運動與Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信號通路研究進展

羅琳張纓

1北京體育大學運動人體科學學院（北京 100084）2貴州師范大學體育學院（貴州 貴陽 550001）

運動與Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信號通路研究進展

羅琳1，2張纓1

1北京體育大學運動人體科學學院（北京 100084）2貴州師范大學體育學院（貴州 貴陽 550001）

Keap1-Nrf2-ARE信號通路是機體重要的抗氧化應激調(diào)節(jié)通路，在清除活性氧，保護機體免受缺氧、炎癥、氧化應激等反應帶來的細胞損傷中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。本文綜述Nrf2的分子結(jié)構(gòu)、Nrf2基因多態(tài)性與運動能力、運動激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路以及影響Keap1-Nrf2-ARE信號通路與運動關(guān)系等方面的最新研究進展，以期為運動訓練、運動員選材、運動性疲勞的預防及低氧訓練等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供理論參考。

運動；Keap1-Nrf2-ARE；信號通路；氧化應激

某些條件（如疾病、炎癥、運動）會使機體由于代謝失常產(chǎn)生大量的自由基，從而造成細胞內(nèi)氧化還原反應失衡，氧化應激水平增加，以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的破壞，進一步導致細胞損傷、正常功能喪失甚至凋亡。研究表明，Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）、核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2related factor 2，Nrf2）以及Nrf2靶基因DNA啟動子上的抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）共同組成的Keap1-Nrf2-ARE信號轉(zhuǎn)導通路，在抗氧化應激中起著十分重要的作用[1-3]。

目前人們對Keap1-Nrf2-ARE信號通路的研究多見于醫(yī)學領(lǐng)域，主要集中在對糖尿病、腫瘤和老年退行性病變等多種疾病的影響及其影響機制方面[4-6]。而關(guān)于運動與Keap1-Nrf2-ARE信號通路的研究相對甚少，本文就Nrf2的分子結(jié)構(gòu)、Nrf2基因多態(tài)性與運動能力、運動激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路以及影響Keap1-Nrf2-ARE信號通路與運動關(guān)系的因素等作一綜述。

1 Nrf2的基本分子結(jié)構(gòu)

Nrf2屬于轉(zhuǎn)錄因子Cap-n-collar（CNC）家族，含有高度保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。Nrf2含有6個結(jié)構(gòu)域（Nrf2-ECH homology，Neh），分別是Neh1、Neh2、Neh3、Neh4、Neh5和Neh6區(qū)。Neh1區(qū)包含1個C端亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（basic leucime zipper，bZip），bZip與細胞核內(nèi)小Maf蛋白結(jié)合形成異源二聚體，進而識別和獲得與Nrf2靶基因DNA啟動子上特殊結(jié)合序列ARE的結(jié)合能力；Neh2區(qū)參與與Keap1的結(jié)合；Neh3區(qū)與Nrf2維持轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)；Neh4和Neh5區(qū)參與下游靶基因轉(zhuǎn)錄的激活；Neh6區(qū)為氧化還原非敏感區(qū)，在氧化應激狀態(tài)下與Nrf2的降解有關(guān)[7-8]。

2 Nrf2基因多態(tài)性與運動能力

研究表明，Nrf2基因多態(tài)性與運動能力有關(guān)聯(lián)。波蘭賽艇運動員在Nrf2基因rs7181866位點上，基因AA型運動員所占比例明顯高于其他非耐力項目運動員[9]。Eynon發(fā)現(xiàn)，在對中長跑運動員的研究中對上述結(jié)果也得到了證實，中長跑運動員AA型所占比例顯著高于短跑運動員和普通人[10]。因此，有學者提出將Nrf2的基因多態(tài)性檢測作為耐力運動員選材的參考指標[11]。但這些研究結(jié)果是否適用于所有人群或人種，還需要進一步研究證實。

3 運動激活Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信號通路

機體有氧代謝過程中會產(chǎn)生包括超氧陰離子、單線態(tài)氧、羥由基、過氧化氫、一氧化氮和脂質(zhì)過氧化自由基等在內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）。正常情況下，機體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，當機體遇到缺氧、氧化應激和炎癥等多種因素影響下，可造成體內(nèi)ROS失衡，直接激活ROS介導的信號通路，引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等大分子生物分子破壞損傷以及細胞凋亡等，最終導致機體運動性疲勞的發(fā)生[11-13]。研究表明ROS是Nrf2活化的關(guān)鍵因子，可激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路[1]，具體過程如下：

在正常狀況下，Nrf2與Keapl形成二聚體，通過泛

素化降解作用，抑制Nrf2活性，使Nrf2的表達保持在較低水平[1]。但劇烈運動可引起運動性內(nèi)源性ROS產(chǎn)生迅速增多，引發(fā)Keapl的構(gòu)象發(fā)生改變，使得Nrf2與Keapl解偶聯(lián)，解離的Nrf2進入細胞核通過其Neh1區(qū)的bZip結(jié)構(gòu)與核內(nèi)小Maf蛋白結(jié)合形成異源二聚體，進而與靶基因啟動子上的ARE結(jié)合，啟動下游包括過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase，SOD）、NADPH醌氧化還原酶1（NADPH quinine oxidoreductase1，NQO1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）和血紅素加氧酶1（hemeoxygenase1，HO-1）等一系列抗氧化酶和II解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄[7、8、14]，從而促進抗氧化酶的表達，有效清除體內(nèi)產(chǎn)生的過剩自由基，并將體內(nèi)外源和內(nèi)源性的有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無害的代謝產(chǎn)物，排除體外[15-16]。見圖1。

4 影響Keap1-Nrf2-ARE信號通路與運動關(guān)系的因素

4.1 運動形式

由于運動形式不同，氧化應激的刺激不同，進而對機體Keap1-Nrf2-ARE信號通路的影響也會不同。Muthusamy[17]的研究發(fā)現(xiàn)安靜狀態(tài)下Nrf2基因敲除鼠與野生鼠相比，小鼠心肌組織的抗氧化酶蛋白表達量沒有顯著差異，但在急性運動刺激后，Nrf2基因敲除小鼠體內(nèi)的抗氧化酶蛋白表達量顯著低于正常野生鼠。另有研究表明，一次急性劇烈運動可提高小鼠骨骼肌Nrf2靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄[18]、腎臟[1、19]和心肌細胞[20]的大多數(shù)抗氧化酶基因的表達。一次性急性運動骨骼肌Nrf2與ARE的結(jié)合活性與運動時間呈正相關(guān)[18]。MacNeil[21]發(fā)現(xiàn)青年受試者一次3小時的急性運動后股外側(cè)肌Nrf2核蛋白含量較運動前增加了40.1%。有研究表明Nrf2的表達依賴于運動強度，隨著運動強度增強，Nrf2表達增加[22]。但也有研究表明，大鼠力竭性跑臺運動后即刻骨骼肌Nrf2蛋白表達、靶基因GR、Gpx1、GST蛋白表達和酶活性變化不大，但靶基因NQO1蛋白表達和酶活性顯著性降低[23]。過于激烈的急性運動會造成明顯的Nrf2異位和ARE結(jié)構(gòu)損傷[24]，影響Keap1-Nrf2-ARE信號通路的轉(zhuǎn)導，進而影響機體抗氧化應激作用的發(fā)揮。相對于急性劇烈運動，長時間低強度的一次運動后Nrf2的蛋白表達趨于穩(wěn)定，未見明顯Nrf2結(jié)構(gòu)損傷，有利于Nrf2的抗氧化作用[24-25]。

眾所周知，長期耐力訓練可以使機體線粒體數(shù)目增加，氧化磷酸化能力增強，ATP生成增多。而長期耐力訓練可使Nrf2轉(zhuǎn)錄活性和表達量增加[26-27]，因此，有人推測Nrf2除了在長期耐力訓練中發(fā)揮機體抗氧化作用外，Nrf2可能在耐力訓練誘導線粒體生物合成和氧化磷酸化過程中也起重要的作用[28]。

4.2 性別

性別差異會影響Keap1-Nrf2-ARE信號通路的抗氧化應激能力。有研究發(fā)現(xiàn)，4周跑臺運動后，雄性Nrf2

基因敲除鼠平均每天跑距比雄性野生鼠顯著低51%，而雌性Nrf2基因敲除鼠和雌性野生鼠差異不大[29]。推測雄性Nrf2基因敲除鼠運動能力的下降主要是由于Nrf2介導的抗氧化應激損傷所致。性別造成激素水平不同，從而引起運動、心血管和代謝系統(tǒng)上的差異，可能是性別對Keap1-Nrf2-ARE信號通路與運動關(guān)系影響的主要因素。至于具體的影響程度仍有待于進一步深入研究。

4.3 年齡

運動激活Keap1-Nrf2-ARE通路信號的轉(zhuǎn)導也受年齡的影響。老年人進行適當?shù)闹械葟姸冗\動，機體產(chǎn)生的自由基不僅對人體無害，反而可激活Keap1-Nrf2-ARE通路，促進抗氧化酶生成，有益于機體的健康[2]。長期適宜強度運動可以改善與年齡相關(guān)的抗氧化能力下降[19、24]。有研究表明，老年和青年受試者進行30分鐘亞極量強度的自行車運動后，骨骼肌核蛋白Nrf2、SOD1和SOD2的表達均顯著增加，并在24小時內(nèi)可恢復到基線水平，但青年組的SOD1表達較老年組更為明顯[30]。老年小鼠經(jīng)過耐力訓練后再進行大強度急性運動，心肌Nrf2蛋白表達水平可接近于幼齡小鼠。結(jié)果顯示，長期適宜強度訓練可以增強Nrf2的內(nèi)源性保護機制，抵抗年齡增長引起的自由基增加，對保護心肌免受氧化應激性損傷有著積極的作用[26]。

4.4 氧濃度

環(huán)境氧濃度的高低會對機體抗氧化應激能力產(chǎn)生影響。劉永[31]采用模擬低氧暴露觀察小鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞C2C12ROS、Nrf2蛋白表達等的變化，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)低氧預處理對H202誘導的C2C12細胞活性損傷有明顯改善，且與常氧H2O2預處理組相比，低氧預處理組細胞內(nèi)ROS含量顯著下降，Nrf2蛋白含量顯著增加，表明適度的低氧可促進Nrf2消除H2O2引起的骨骼肌細胞中ROS的生成增加。在體實驗也有類似的結(jié)果，Nrf2基因敲除小鼠在低氧條件下，抗氧化蛋白的表達顯著降低而氧化應激反應明顯增強，表明Keap1-Nrf2-ARE信號通路是低氧下機體抗氧化的主要通路[32-33]。

Keap1-Nrf2-ARE通路的激活不僅能緩解機體因低氧造成的氧化應激反應，同樣在高氧濃度環(huán)境的應激反應中也起著一定作用。蔡成發(fā)現(xiàn)[34]，早產(chǎn)鼠高氧暴露4～7天后肺組織中Nrf2mRNA表達顯著增強，提示高氧暴露可能通過上調(diào)Nrf2活性，提高機體抗氧化能力，減輕高氧肺損傷。

當人體在不同氧濃度的環(huán)境中運動時，對Keap1-Nrf2-ARE信號通路的影響作用則變得更為復雜，弄清低氧訓練及高氧恢復時該信號通路的變化及其調(diào)節(jié)機制，將有助于人體運動能力的提高和機體疲勞的恢復。

近年來，氧化應激對Keap1-Nrf2-ARE信號通路的影響及其機制研究已涉及醫(yī)學的多種疾病領(lǐng)域，而運動對Keap1-Nrf2-ARE信號通路轉(zhuǎn)導的影響，開闊了運動生理生化研究的新視野。運動對Keap1-Nrf2-ARE信號通路的上、下游調(diào)節(jié)作用及反饋機制目前仍不十分清楚，需要進一步研究。該方面的研究將會在運動訓練、運動員選材、運動性疲勞的預防及低氧訓練等相關(guān)研究領(lǐng)域有著廣闊的應用前景。

[1]Asghar M，George L，Lokhandwala MF.Exercise decreases oxidative stress and inflammation and restores renal dopamine D1 receptor function in old rats.Am J Physiol Renal Physiol，2007，293（3）：F914-F919.

[2]Gomez-Cabrera MC，Domenech E，Vina J.Moderate exercise isanantioxidant：upregulationofantioxidantgenesby training.Free Radic Biol Med，2008，44（2）：126-131.

[3]Ganan-Gomez I，Weiy，Yank H，et al.On cogenic functions of the transcription factor Nrf2.Free Radic Biol Med，2013，65（6）：65750-65764.

[4]Tan Y，Ichikawa T，Li J，et al.Diabetic downregulation of Nrf2 activity via ERK contributes to oxidative stress-induced insulin resistance in cardiac cells In vitro and in vivo. Diabetes，2011，60（2）：625-633.

[5]Xue M，Qian Q，Adaikalakoteswari A，et al.Activation of NFE2-related factor-2 reverses biochemical dysfunction of endothelial cells induced by hyperglycemia linked to vascular disease.Diabetes，2008，57（10）：2809-2817.

[6]Jung KA，Kwak MK.The Nrf2 system as a potential target for the development of indirect antioxidants.Molecules，2010，15（10）：7266-7291.

[7]Baud L，Swift S，Lleres D，et al.Monitoring Keapl-Nrf2 interacdons in single live cells.Biotechnol Adv，2014，32（6）：1133-1144.

[8]Jain AK，Bloom DA，Jaiswal AK.Nuclear import and export signals in control of Nrf2..J Biol Chem，2005，32（9）：29158-29168.

[9]Maciejewska-Karlowska A，Leonska-Duniec A，Cieszczyk P，et al.The GABPB1 gene A/G polymorphism in Polish rowers. J Hum Kinet，2012，31（6）：115-120.

[10]Eynon N，Alves AJ，Sagiv M，et al.Interaction between SNPs in the NRF2 gene and elite endurance performance.Physi Gen，2010，41（1）：78-81.

[11]Cho H.Genomic structure and variation of nuclear factor（erythroid-derived 2）-like 2.Oxid Med Cell Longev，2013，13（10）：1-24.

[12]Powers SK，Ji LL，Leeuwenburgh C..Exercise training-induced alterations in skeletal muscle antioxidant capacity：a brief review.Med Sci Sports Exerc，1999，31（7）：987-997.

[13]Manfredi TG，F(xiàn)ielding RA，O'Reilly KP，et al.Plasma creatine kinase activity and exercise-induced muscle damage in older

men.Med Sci Sports Exerc，1991，23（9）：1028-1034.

[14]Ishii T，Itoh K，Takahashi S，et al.Transcription factor Nrf2 coordinately regulates a group of oxidative stress-inducible genes in macrophages.J Biol Chem，2000，275（21）：16023-16029.

[15]Moi P，Chan K，Asunis，et al.Isolation of NF-E2-related factor 2（Nrf2），a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region.Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America，1994，91（21）：9926-9930.

[16]Reuland DJ，Khademi S，Castle CJ，et al.Upregulation of phase II enzymes through phytochemical activation of Nrf2 protects cardiomyocytes against oxidant stress.Free Radic Biol Med，2013，56（2）：102-111.

[17]Muthusamy VR，Kannan S，Sadhaasivam K，et al.Acute? exercise stress activates Nrf2/ARE signaling and promotes antioxidant mechanisms in the myocardium.Free Radic Biol Med，2012，52（2）：366-376.

[18]李鐵瑛，何詩依，劉思雪，等.急性運動對小鼠骨骼肌核蛋白Nrf2-ARE結(jié)合活性的影響.中國運動醫(yī)學雜志，2015，34（7）：649-652+687.

[19]George L，Lokhandwala MF，Asghar M..Exercise activates redox sensitive transcription factors and restores renal D1 receptor function in old rats.Am J Physiol Renal Physiol，2009，297（5）：1174-1180.

[20]Safdar A，deBeer J，Tarnopolsky MA.Dysfunctional Nrf2-Keap1 redox signaling in skeletal muscle of the sedentary old .Free Radic Biol Med，2010，49（10）：1487-1493.

[21]Macneil LG，Safdar A，Baker SK，et al.Eccentric exercise affects NRF2-mediated oxidative stress response in skeletal muscle by increasing nuclear NRF2 content.Med Sci Sports Exerc，2011，43（5）：383.

[22]KimSY，LeeYS，SurhYJ.EffectsofExerciseon InflammatoryandAntioxidativeResponsesinHuman Peripheral Blood Mononuclear Cells：NF-kappa B and Nril as Potential Mediators.Free Radic Biol Med，2011，51（3）：13-14.

[23]Malauti M，Angeloni C，Garatachea N，et al.Sulforaphane treatment protects skeletal muscle against damage induced by exhaustive exercise in rats.J Appl Physiol，2009，107（4）：1028-36.

[24]GounderSS，KannanS，DevadossD，etal.Impaired transcriptional activity of Nrf2 in age-related myocardial oxidative stress is reversible by moderate exercise training. PLo S one，2012，7（9）：1-12.

[25]Souza PS，Rocha LGC，Tromm CB，et al.Therapeutic action of physical exercise on markers of oxidative stress induced by chronic kidney disease.Life Sci，2012，91（12）：132–136.

[26]Jiang HK，Miao Y，Wang YH，et al.Aerobic interval training protectsagainstmyocardialinfarction-inducedoxidative injury by enhancing antioxidase system and mitochondrial biosynthesis.Clin Exp Pharmacol，2014，41（3）：192-201.

[27]Baar K，Werdea R，Jonest E，et al.Adaptations of skeletal muscle to exercise rapid increase in the transcriptional coacti vator PGC-1.FASCB，2002，16（14）：1879-1886.

[28]Martin LP，Stephen L.Nrf2，a master regulator of detoxification and also antioxidant，anti-infammatory and other cytoprotective mechanisms，is raised by health promoting factors. Acta Physiologica Sinica，2015，67（1）：1-18.

[29]Vomhof-DekreyEE，PickloMJ.LackofNrf2reduces voluntary exercise in mice influences of sex and diet.Free Radi Bio and Med，2011，51（11）：58-59.

[30]Done A，Plummer J，Rice J，et al.Acute Exercise Activates Nrf2 in Young and Older Adults.Free Radic Biol Med，2014，76（2）：31-31.

[31]劉永，李俊平，羅冬梅.C2Cl2預處理對C2C12細胞氧化損傷后增殖和Nrf2表達的影響.中國運動醫(yī)學雜志，2014，33（3）：238-241.

[32]Kuang L，F(xiàn)eng J，He G，，et al.Knockdown of Nrf2 inhibits the angiogenesis of rat cardiac microvascular endothelial cells under hypoxic conditions.Int J Biol Sci，2013，9（7）：656-665.

[33]SethyNK，SinghM，KumarR，etal.Upregulationof transcription factor NRF2-mediated oxidative stress response pathway in rat brain under short-term chronic hypobaric hypoxia.Funct Integr Genomics，2011，11（1）：119-137.

[34]蔡成，陳盛，呂勤，等.高氧暴露下早產(chǎn)鼠肺組織Nrf'2和Cytc的表達及意義.中國全科醫(yī)學，2014，12（7）：1020-1022.

2016.01.15

國家自然科學基金項目（項目編號：31471134）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費資助北京體育大學自主課題（項目編號：2016BS026）

張纓，Email：zhyi9256@126.com