減毒單增李斯特菌載體在腫瘤疫苗中的應(yīng)用①

賈艷艷 劉莎莎 汪 洋 丁 軻 程相朝 張春杰

(河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動(dòng)物疫病與公共安全院士工作站，洛陽(yáng)471003)

減毒單增李斯特菌載體在腫瘤疫苗中的應(yīng)用①

賈艷艷 劉莎莎 汪 洋 丁 軻 程相朝 張春杰

(河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南省動(dòng)物疫病與公共安全院士工作站，洛陽(yáng)471003)

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocyto-genes,LM)是一種宿主譜廣泛的兼性胞內(nèi)菌。LM具有進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞(APCs)如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)等細(xì)胞胞質(zhì)的特性，使其運(yùn)送外源抗原進(jìn)入MHCⅠ分子和MHCⅡ分子抗原提呈途徑，從而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD8+和CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答[1]。因此，減毒LM已被公認(rèn)為是一類(lèi)理想的腫瘤疫苗載體[2]。

1 生物學(xué)特性

LM是一種革蘭氏陽(yáng)性兼性胞內(nèi)菌，一般通過(guò)消化道感染，然后通過(guò)腸上皮細(xì)胞散播至全身。一部分細(xì)菌通過(guò)內(nèi)化素InlA或InlB進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞等非吞噬細(xì)胞，散在的細(xì)菌則被巨噬細(xì)胞和吞噬細(xì)胞如肝臟的Kupffer細(xì)胞所吞噬，在胞內(nèi)LM通過(guò)分泌毒力因子溶血素O(Listeriolysin O，LLO)和磷脂酶C(Phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)降解吞噬體膜進(jìn)入細(xì)胞胞漿中復(fù)制，并通過(guò)誘導(dǎo)宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚集，在細(xì)菌表面形成極化的肌動(dòng)蛋白尾，促使LM在胞漿內(nèi)運(yùn)動(dòng)并向鄰近細(xì)胞擴(kuò)散[3]。

2 LM感染后誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答

2.1 天然免疫應(yīng)答 LM進(jìn)入機(jī)體后，可以感染肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC等多種細(xì)胞。LM表面有一系列Toll樣受體配體(TLR-L)如肽聚糖、脂蛋白、脂磷壁酸及核苷酸結(jié)合寡聚區(qū)(Nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)，能夠被細(xì)胞表面受體識(shí)別，進(jìn)而釋放前炎性因子和趨化因子，并激發(fā)一系列的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮天然免疫應(yīng)答作用[4]。另外，LM還可誘導(dǎo)DC表面共刺激分子(CD40、CD80和CD86)的表達(dá)及招募NK細(xì)胞至感染部位釋放產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)APCs的成熟[5]。LM感染產(chǎn)生強(qiáng)烈的天然免疫應(yīng)答，能直接或間接地促進(jìn)獲得性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。

2.2 獲得性免疫應(yīng)答 LM感染過(guò)程中，溶酶體中的LM被降解為抗原短肽可結(jié)合MHCⅡ類(lèi)分子，從而被CD4+T細(xì)胞識(shí)別，并誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，且該過(guò)程釋放的Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-2等又能輔助CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的產(chǎn)生。逃逸至胞漿中的LM釋放外源抗原快速進(jìn)入蛋白降解途徑，被降解成抗原肽與MHCⅠ類(lèi)分子結(jié)合形成肽復(fù)合物提呈至CD8+T細(xì)胞，活化后的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生穿孔素、顆粒蛋白酶及IFN-γ等介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[6]。除CD4+T細(xì)胞和CD8+T效應(yīng)細(xì)胞外，LM還激活非傳統(tǒng)的T細(xì)胞亞群如γ δ T細(xì)胞、NK T細(xì)胞發(fā)揮免疫保護(hù)性效應(yīng)[7]。因LM可不經(jīng)過(guò)胞外環(huán)境完成胞間感染，使其主要以細(xì)胞免疫應(yīng)答為主，這也是LM作為腫瘤疫苗載體的重要優(yōu)勢(shì)之一。

3 LM毒力致弱策略

當(dāng)重組活載體疫苗應(yīng)用于臨床時(shí)，安全性顯得尤為關(guān)鍵，因此在設(shè)計(jì)LM載體疫苗時(shí)需要在保持免疫原性的同時(shí)，降低其致病性。目前主要有4種LM致弱策略：如刪除毒力因子、平衡互補(bǔ)系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)缺陷株及“Killed but metabolically active”(KBMA)菌株。

在這幾種致弱方法中，刪除毒力因子是最常采用的方法，不過(guò)該方法所面臨的挑戰(zhàn)是如何在刪除毒力因子的同時(shí)，仍保留其良好的免疫潛能。LM的毒力基因ActA編碼肌動(dòng)蛋白聚集蛋白(Actin polymerizing protein，ActA)，主要促使LM完成胞間傳遞，plcB也是LM的重要毒力基因之一[8]。Haroula等[9]構(gòu)建了LMΔactA/ΔplcB缺失株，研究顯示成年志愿者口服LMΔactA/ΔplcB突變株后沒(méi)有表現(xiàn)出臨床病理癥狀，并且部分志愿者體內(nèi)產(chǎn)生了特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。Ma等[10]構(gòu)建了表達(dá)外源抗原的LMΔactA/ΔinlB突變株，研究表明該減毒重組株在體內(nèi)毒性顯著降低，且仍具有刺激天然免疫應(yīng)答和誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，以上這些減毒株都是良好的潛在疫苗載體。

prfA基因是LM基因組中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因。Wood等[11]構(gòu)建了prfA平衡互補(bǔ)系統(tǒng)，并將此方法成功應(yīng)用于多種癌癥治療性疫苗的開(kāi)發(fā)。該方法是將攜帶目標(biāo)抗原及PrfA的多拷貝質(zhì)粒pAM401導(dǎo)入至prfA缺失株，該菌株比野生菌毒力下降約4個(gè)數(shù)量級(jí)，仍保持較好的侵襲能力。

丙氨酸外消旋酶基因(alanine racemase gene，dal)和氨基轉(zhuǎn)移酶基因(αD-amino acid aminotransferase gene，dat)負(fù)責(zé)LM細(xì)胞壁所需D-丙氨酸的合成。Zhao等[12]構(gòu)建LMΔdal/Δdat營(yíng)養(yǎng)缺陷株，通過(guò)攜帶消旋酶基因的質(zhì)粒在IPTG的誘導(dǎo)下供給LMΔdal/Δdat缺失株生存所需的D-丙氨酸，該缺失株在小鼠體內(nèi)是無(wú)毒的，能被機(jī)體很快清除，并且保留著CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)性功能。

以上致弱細(xì)菌方法中，易導(dǎo)致細(xì)菌侵襲宿主細(xì)胞能力的下降，從而影響其免疫原性。Skoberne等[13]應(yīng)用一種新方法改造LM為不能復(fù)制但仍保持新陳代謝狀態(tài)(KBMA)。研究顯示應(yīng)用表達(dá)外源抗原的KBMA LM菌株免疫小鼠能抵抗病毒入侵和抑制腫瘤生長(zhǎng)，且較為安全。

4 重組LM載體腫瘤疫苗的研究進(jìn)展

1992年，Schafer等[14]首次報(bào)道LM運(yùn)送外源抗原能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。隨后，Pan等[15]研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)模式腫瘤抗原的重組LM菌株免疫腫瘤小鼠能引起肉眼可見(jiàn)的腫瘤消退，顯示LM載體通過(guò)運(yùn)送腫瘤抗原發(fā)揮良好的抗腫瘤作用。從此，LM作為疫苗載體進(jìn)行癌癥免疫預(yù)防和治療研究已成為眾多學(xué)者的研究方向之一。

當(dāng)前重組減毒LM疫苗的構(gòu)建策略有多種。其中最常見(jiàn)的是平衡致死互補(bǔ)系統(tǒng)，即將多拷貝重組質(zhì)粒pGG-55轉(zhuǎn)化至LMΔprfA，pGG-55攜帶prfA基因與宿主菌構(gòu)成互補(bǔ)系統(tǒng)，其攜帶hly或actA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)LLO或ActA與外源抗原實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)[16]。其次，采用溫敏型質(zhì)粒pKSV7，利用同源重組技術(shù)將目標(biāo)抗原定點(diǎn)整合至LM基因組，該重組菌不需要抗生素維持，在臨床應(yīng)用方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[17]。還可以利用整合型載體pPL1或pPL2將外源抗原定點(diǎn)整合至LM基因組的非必需區(qū)域(comK或tRNA Arg基因片段處)，該方法只需一步，快速便捷，但需抗生素的維持[18]。

4.1 LM載體表達(dá)外源腫瘤蛋白抗原的研究 最初，LM主要運(yùn)送一些模式抗原如β-半乳糖苷酶、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)及流感病毒核蛋白NP[19]進(jìn)行抗腫瘤研究。重組減毒LM疫苗能夠誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的CTL應(yīng)答，從而減慢腫瘤發(fā)展進(jìn)程。

目前，利用減毒LM活載體進(jìn)行腫瘤疫苗的研究正在如火如荼地進(jìn)行，其運(yùn)送的腫瘤抗原包括人乳頭瘤病毒HPV16 E7抗原、黑色素瘤抗原Mage-b、高分子量的黑色素瘤相關(guān)抗原HMW-MAA、前列腺特異抗原PSA、間皮素mesothelin、抑癌蛋白P53，肝癌抗原等[20-26]。研究顯示重組李斯特菌疫苗免疫小鼠均能夠誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答，在小鼠腫瘤模型中顯示良好的抗腫瘤效果，且不產(chǎn)生明顯的副作用。

Seavey等[27]利用減毒李斯特菌表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2又稱(chēng)fetal liver kinase-1)進(jìn)行腫瘤血管抑制免疫療法。其中構(gòu)建的LM-LLO-Flk1菌株免疫小鼠能夠誘導(dǎo)抗腫瘤CTL應(yīng)答的產(chǎn)生，導(dǎo)致肉眼可見(jiàn)腫瘤的消退，降低殘余腫瘤的微血管密度，從而能夠保護(hù)小鼠抵抗多種腫瘤細(xì)胞的攻擊及腫瘤轉(zhuǎn)移，顯示該重組菌具有廣泛的抗腫瘤作用。

由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)是免疫特赦區(qū)，因此在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤面臨一些難題如免疫應(yīng)答較弱等。Prins[28]構(gòu)建兩株重組減毒李斯特菌疫苗即LM-NP(NP396-404)及LM-NP/TRP-2(NP396-404和TRP180-188)，結(jié)果表明LM-NP/TRP-2誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的IFN-γ水平及強(qiáng)烈的TRP-2特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，通過(guò)生物素影像觀(guān)察免疫小鼠的顱內(nèi)腫瘤與對(duì)照小鼠相比顯著減小，并能延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。以上這些研究結(jié)果為中樞系統(tǒng)腫瘤性疾病的臨床免疫治療帶來(lái)了福音。

Lori等[29]將LM-LLO-E7已應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)中選取110名復(fù)發(fā)性宮頸癌患者接受3個(gè)劑量或4個(gè)劑量LM-LLO-E7后，12個(gè)月存活期患者比例達(dá)到36%，18個(gè)月存活期比例達(dá)22%，11%的患者體內(nèi)產(chǎn)生了較強(qiáng)的特異性免疫應(yīng)答，研究顯示重組減毒李斯特菌具有很好的應(yīng)用前景。

4.2 LM載體運(yùn)送cDNA/mRNA的研究 由于細(xì)菌表達(dá)抗原屬于原核表達(dá)，缺乏翻譯后修飾及存在classⅡ類(lèi)T細(xì)胞表位的空間構(gòu)象問(wèn)題。為此，學(xué)者利用LM載體運(yùn)送cDNA或mRNA，當(dāng)重組菌進(jìn)入胞漿后被裂解進(jìn)而釋放質(zhì)粒，利用宿主細(xì)胞進(jìn)行外源抗原的表達(dá)，這種運(yùn)送方式被稱(chēng)為“bactofe-ction”[30]。該方式比DNA疫苗更有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。證實(shí)該方式構(gòu)建的疫苗免疫小鼠可誘導(dǎo)特異性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，且能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。但遺憾的是，研究表明這種bactofection方式的免疫效力不如LM疫苗運(yùn)送蛋白抗原的方式[31]。

4.3 LM自身具有抗腫瘤作用及靶向腫瘤組織 LM對(duì)腫瘤組織有特殊的偏好性。Claudia等[32]報(bào)道LM能夠靶向腫瘤，不僅將腫瘤抗原運(yùn)送至腫瘤組織，而且通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平增高引起腫瘤細(xì)胞的死亡，證實(shí)了LM自身具有抗腫瘤作用，這些研究結(jié)果為L(zhǎng)M腫瘤疫苗載體的開(kāi)發(fā)提供重要理論基礎(chǔ)。

5 載體免疫應(yīng)答對(duì)重組疫苗免疫效果的影響

活載體疫苗研發(fā)面臨的一個(gè)重要問(wèn)題是體內(nèi)已存在的載體是否會(huì)減弱目標(biāo)抗原誘發(fā)的免疫應(yīng)答，尤其LM是環(huán)境中普遍存在的一類(lèi)微生物。Starks等[33]研究表明小鼠體內(nèi)已存在LM抗體不會(huì)阻礙重組LM疫苗誘導(dǎo)功能性T細(xì)胞的活化、增殖及分化；同時(shí)Leong等[34]報(bào)道人類(lèi)體內(nèi)LM載體免疫應(yīng)答不會(huì)降低重組疫苗誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答。以上研究為重組李斯特菌腫瘤疫苗的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

6 展望

由于LM的獨(dú)特胞內(nèi)生活史及其誘導(dǎo)強(qiáng)烈的MHCⅠ類(lèi)免疫應(yīng)答特性，使其作為腫瘤疫苗載體具有眾多優(yōu)勢(shì)，并在抗腫瘤研究中顯示較好的預(yù)防性和治療性效果，但是該載體也存在一些需要優(yōu)化的地方，如疫苗是否能穩(wěn)定表達(dá)外源抗原以及疫苗的安全性等。因此，在構(gòu)建重組疫苗時(shí)采用什么方法既降低細(xì)菌的毒力，同時(shí)又能保持其強(qiáng)烈的免疫原性，是研究者重點(diǎn)考慮的問(wèn)題。我們相信隨著研究的不斷深入，減毒李斯特菌重組疫苗會(huì)得到不斷的優(yōu)化和改進(jìn)，從而可以更好地應(yīng)用于腫瘤性疾病的預(yù)防和治療。

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[收稿2016-01-05 修回2016-03-19]

(編輯 許四平)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.032

①本文受河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(No.142102110039)、河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.14A230005)、河南科技大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金(No.09001733)、河南科技大學(xué)高級(jí)別項(xiàng)目培育基金項(xiàng)目(No.2015GJB030)和河南科技大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助。

賈艷艷(1983年-)，女，博士，副教授，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)方面的研究，E-mail:jiayanyan0120@163.com。

Q789

A

1000-484X(2016)12-1866-04