豬繁殖與呼吸綜合征病毒樣顆粒的構(gòu)建

譚 波　袁 芳

（1.重慶市潼南區(qū)龍形鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶　402672；2.重慶市潼南區(qū)小渡鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶　402681）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒樣顆粒的構(gòu)建

譚 波1袁 芳2

（1.重慶市潼南區(qū)龍形鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶402672；2.重慶市潼南區(qū)小渡鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，重慶402681）

豬繁殖與呼吸綜合征俗稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種接觸性的傳染病，主要引起母豬流產(chǎn)及仔豬呼吸系統(tǒng)障礙，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病尚無特效藥治療，臨床上主要采用弱毒疫苗和滅活疫苗預(yù)防免疫，但其存在免疫效果差和返毒等缺陷，使得人們不得不轉(zhuǎn)向其他新型疫苗的研制以控制PRRSV的發(fā)生和流行。

病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是利用基因工程重組技術(shù)，將病毒產(chǎn)生免疫效應(yīng)的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因重組在表達(dá)載體中，在原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，使其自動(dòng)裝配成空心顆粒，大小介于 15～400nm之間，形態(tài)上與真正的病毒粒子相似，能 激 發(fā) 機(jī) 體 有 效 的 免 疫 應(yīng) 答。近 幾 年，PRRS 病毒樣顆粒疫苗的研究也成為了熱點(diǎn)，并取得了一定的成果。本試驗(yàn)采用桿狀病毒 - 昆蟲表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá) PRRSV 的 GP5 蛋白和 M 蛋白，包裝PRRSV 病毒樣顆粒。PRRSV 的 GP5 蛋白及 M 蛋白在病毒的增殖與誘導(dǎo)免疫應(yīng)答過程中起關(guān)鍵作用。因 此，本 研 究 選擇 GP5 蛋 白 和 M 蛋 白 對PRRSV VLPs的形成進(jìn)行探索，旨在為研制新型的PRRS疫苗奠定基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

菌株和質(zhì)粒HP - PRRSV CQ 毒株由重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl 、 Sf9昆蟲細(xì)胞、大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均由重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工 程 學(xué) 院 生 物 制 藥 實(shí) 驗(yàn) 室 保 存。大 腸桿 菌DH10Bac購自北京天恩澤科技有限公司。pUC57-GP5 - M 質(zhì)粒由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

2　基因與引物的設(shè)計(jì)合成

選取 HP - PRRSV CQ 毒株的 GP5 和 M 蛋白的全部編碼基因序列，使用 Vector NTI 軟件進(jìn)行密碼子的優(yōu)化，提高密碼子的適應(yīng)指數(shù)；并在2 個(gè)基因之間加入終止子和啟動(dòng)子基因，使得兩種蛋白能夠連續(xù)表達(dá)；優(yōu)化后的序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，克隆于 pUC57質(zhì)粒中。

我國市場中 PRRS 滅活疫 苗主 要 有針 對高致 病 性 毒 株 的NVDC - JXA1及針對經(jīng)典毒株的 CH-1a和 SD1疫苗，但在使用過程中存在免疫效果差，甚至不能抵抗同源毒株感染的問題；用JXA1株、HUN4- F112株等制成的弱毒疫苗在國內(nèi)均受到許可，其免疫效果和免疫期均強(qiáng)于滅活疫苗，但鑒于其存在返毒的危險(xiǎn)，在使用該疫苗時(shí)需特別慎重。某些歐洲國家（如德國）禁止用弱毒疫苗來預(yù)防 PRRS，主要采取撲殺的方法凈化豬群；美洲和亞洲國家提倡在未發(fā)生PRRS 的豬場中避免使用弱毒疫苗，弱毒疫苗只可用在存在 PRRS 的豬群。因此，開發(fā)安全有效的新型疫苗勢在必行。

病毒樣顆粒疫苗作為一種新型的亞單位疫苗，具有免疫原性好、安全性高、易于大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)。鑒于 VLPs 疫苗具有無可比擬的優(yōu)勢，它已經(jīng)被成功地應(yīng)用于輪狀病毒、人乳頭瘤病毒、丙肝病毒等疫苗的研發(fā)。目前，幾種流感病毒的VLPs疫苗也得到了很好的發(fā)展，并成功地在豬、犬、鴨、雞體內(nèi)進(jìn)行了免疫效果的評(píng)估，都取得了很好的效果。如呂鳳林等將編碼PRRSV 的 M蛋白、N 蛋白和 GP5 蛋白的基因分別克隆到真核表達(dá)載體（PHWD2000、Popi3CAT、pCAGGS、pcD-NA6/TR、pCMV -HA）中同時(shí)轉(zhuǎn)染同一細(xì)胞系表達(dá)3 種蛋白能形成病毒樣顆粒，并能產(chǎn)生良好的細(xì)胞免疫和體液免疫。楊雷等針對PRRSV 廣西株，利用桿狀病毒 - 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá) PRRSV 的GP5蛋白和N 蛋白，成功組裝成病毒樣顆粒，且該病毒樣顆粒具有很好的免疫效果。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是以桿狀病毒為外源基因載體，昆蟲細(xì)胞或活體昆蟲為受體的真核表達(dá)系統(tǒng)。相對于其他表達(dá)系統(tǒng)，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢：桿狀病毒宿主界限高，通常只感染節(jié)肢動(dòng)物，在人體細(xì)胞中不能復(fù)制，不存在潛在的威脅；桿狀病毒基因組容量大，可插入多個(gè)外源基因，同時(shí)可高效表達(dá)外源基因；昆蟲細(xì)胞作為真核表達(dá)系統(tǒng)能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行糖基化、磷酸化和酰胺化等修飾。

因此，該系統(tǒng)在構(gòu)建病毒樣顆粒疫苗方面具有廣闊的應(yīng)用前景。PRRSV的 GP5蛋白具有很強(qiáng)的抗原表位，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答；M蛋白是 PRRSV中最具保守性的非糖基化囊膜蛋白，在細(xì)胞免疫中扮演著很好的角色。同時(shí)有研究結(jié)果表明，這兩種蛋白質(zhì)通過二硫鍵形成二聚體，該二聚體在病毒出芽時(shí)，能使病毒囊膜彎曲，從而使病毒從宿主中放出來，這在病毒增殖的過程中起到了十分重要的作用。不同于以上研究，本研究針對PRRSV 重慶株，利用桿狀病毒 - 昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，選用體外表達(dá)的PRRSV GP5蛋白、 M 蛋白，并在基因設(shè)計(jì)階段進(jìn)行了密碼子的優(yōu)化，提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量，結(jié)果顯示，共表達(dá)的 GP5、M 蛋白具有天然蛋白的活性，并可以自我組裝成 VLPs，為 PRRS VLPs疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)制備的病毒樣顆粒作為疫苗的效果和前景，還需進(jìn)行相關(guān)的動(dòng)物試驗(yàn)。