雞柔嫩艾美耳球蟲石家莊株RT-PCR的隨機擴增

周炳緒 范治國 周麗娟

（河北省滄州市東光縣農(nóng)業(yè)局，河北東光 061600）

雞柔嫩艾美耳球蟲石家莊株RT-PCR的隨機擴增

周炳緒 范治國 周麗娟

（河北省滄州市東光縣農(nóng)業(yè)局，河北東光 061600）

本試驗通過使用隨機引物，以石家莊地區(qū)柔嫩艾美耳球蟲為模板，建立了RT-PCR方法。首先對石家莊地區(qū)柔嫩艾美耳球蟲的混合卵囊進行分離純化，提取分離純化的孢子化卵囊的總RNA。

雞球蟲病是由艾美耳屬的單細胞寄生蟲引起的嚴重危害家禽生長發(fā)育的一種疾病。雞球蟲分布廣泛、危害大，嚴重威脅養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，尤其對15～30日齡的雛雞危害嚴重，常常造成毀滅性的損失。其發(fā)病率高達50%～70%，死亡率20%～30%，嚴重時高達80%[1］。在雞的各種疾病當(dāng)中，球蟲病的發(fā)生率相當(dāng)高，占1/6～1/5。目前，我國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9種雞球蟲，其中致病性最強的是柔嫩艾美耳球蟲。

但在自然情況下多系混合感染，且以某一種占優(yōu)勢，國內(nèi)外學(xué)者為了研究的方便及研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，常應(yīng)用純種蟲株進行研究。病雞是主要傳染源，凡被帶蟲雞污染過的飼料、飲水、土壤和用具等，都有卵囊存在。雞感染球蟲的途徑主要是吃了感染性卵囊。人及其衣服、用具等以及某些昆蟲都可成為機械傳播者。球蟲蟲卵的抵抗力較強，在外界環(huán)境中一般的消毒劑不易破壞，在土壤中可保持生活力達4～9個月，在有樹蔭的地方可達15～18個月。卵囊對高溫和干燥的抵抗力較弱。當(dāng)相對濕度為21%～33%時，在18℃～40℃溫度下，柔嫩艾美耳球蟲的卵囊經(jīng)1～5d就死亡。

Beate E Sehoitzler，Per L Thebo，F(xiàn)inna M Tomley，et al等研究結(jié)果表明，不同球蟲地理株在抗藥性和致病力之間都表現(xiàn)出不同的抗藥水平，在分子水平也證明了它們之間具有遺傳上的差異。近幾年，隨著河北省省養(yǎng)雞規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)雞戶因雞球蟲病影響所造成的損失也逐漸加大。因此，開展對柔嫩艾美耳球蟲的研究，具有很高的實用價值，也可為雞球蟲病防治策略重點的制定和球蟲苗組成成分的研制提供有價值的資料。本試驗通過對石家莊柔嫩艾美耳球蟲進行RT-PCR，從而得到PCR的擴增結(jié)果，為進一步研究柔嫩艾美耳球蟲提供了依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試動物 三黃120系雞雛，購石家莊某雞場，未落地前用專用雞雛盒運回，飼喂中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所提供的從肉雞全價育雛料，在嚴格消毒的無球蟲環(huán)境中飼養(yǎng)，實驗前檢查未發(fā)現(xiàn)球蟲感染。

1.1.2試劑和器材 勻漿管（5ml）、銅篩（200目、300目、400目）、離心機、恒溫培養(yǎng)箱、2.5%重鉻酸鉀溶液、胃蛋白酶、5%次氯酸鈉、75%乙醇、DEPC、TBE、異丙醇、瓊脂糖、氯仿、蒸餾水、硼酸。

1.1.3實驗器具的處理與準(zhǔn)備 塑料制品（包括槍頭、EP管、勻漿管等）：先將1%DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次（EP管）。玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，報紙烤干備用。勻漿器（包括剪刀、鑷子）：先洗凈后，再180℃干烤4h滅菌（不需要1%DEPC水浸泡）。

1.1.4試劑配制 DEPC水（吸出1m l放在1000m l雙蒸水中配成1%DEPC水，放在1000m l容量瓶中靜置4h備用）、75%乙醇（用無水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存）、異丙醇（放入棕色瓶中）、氯仿（放入棕色瓶中）、瓊脂糖 。

1.1.5電泳緩沖液的配制 Tris54g、 硼酸27.5g、0.5% EDTA 20m l（pH8.0）、蒸餾水（1000m l）、5×TBE（貯存液），再將5×TBE稀釋10倍成0.5TBE就可以在電泳時使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液450ml水即500ml工作緩沖液。

1.2試驗方法

1.2.1蟲種采集 選擇石家莊當(dāng)?shù)夭‰u進行糞便檢查和剖檢，將具有盲腸腫大、盲腸黏膜增厚、盲腸內(nèi)充滿凝固的暗紅色物質(zhì)、盲腸漿膜面可見出血點的病雞盲腸內(nèi)容物和糞便用飽和鹽水漂浮法收集球蟲卵囊，置于2.5%重鉻酸鉀溶液中，在27℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至孢子化，以獲得混合球蟲卵囊。混合的孢子化卵囊液置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2卵囊的分離 取混合的孢子化卵囊液反復(fù)離心數(shù)次，以洗凈重鉻酸鉀液，嗉囊接種于10只5日齡雛雞，于接種后第7天剖殺，取盲腸段內(nèi)容物，收集卵囊，培養(yǎng)在27℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中至孢子化（培養(yǎng)的前18h，每6h輕攪拌1次，以后每天攪拌1～2次）。再經(jīng)無蟲雞體反復(fù)增殖4代，以獲取該次試驗所需孢子化卵囊總量。

1.2.3卵囊的純化 取柔嫩艾美耳球蟲感染2周齡無球蟲雛雞，飼料和飲水中杜絕球蟲污染，每只雞感染5×104卵囊。感染8天后撲殺，然后取出盲腸，用組織粉碎機粉碎。按2mg/m l加入游離。然后用胃蛋白酶，調(diào)節(jié)PH至2.0，然后在39℃消化1h，使卵囊分散銅篩（200目、300目、400目）過濾，2000r/min離心10min，去除上清液，在沉淀中加入1.1mol/m l的蔗糖溶液，再次2000r/min離心10min。重復(fù)幾次，去除比重比卵囊重的雜質(zhì)。然后加入5%的次氯酸鈉，在4℃下作用10min，最后在低濃度的低糖溶液中洗滌，以去除小的雜質(zhì)和次氯酸鈉。即得到了未孢子化的卵囊，然后29℃同期培養(yǎng)2d即可得到純化的孢子化的卵囊。

2　結(jié)果

2.1卵囊的分離與純化的結(jié)果

感染柔嫩艾美耳球蟲7d后，捕殺試驗雞，取盲腸，剖開腸壁，用冷洗脫液洗滌腸黏膜，用載玻片刮取腸黏膜，勻漿，過濾后，離心分離選擇2000rmp離心10min，效果最好。在10×40倍鏡下，可見大量寬卵圓形的卵囊和少數(shù)橢圓形的卵囊。壁光滑，無卵膜孔，無卵囊殘體，有一極體。隨機測量30個卵囊。其大小為20.75 μm～27.83 μm×18.22 μm～20.24 μm，平均為22.71 μm～19.54 μm。參照有關(guān)資料和圖譜[7］，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，符合柔嫩艾美耳球蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

[1]林青，于三科，陳秀荔，等.雞柔嫩艾美耳球蟲單卵囊分離技術(shù)的構(gòu)建及致病性研究[J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2002，30 （3）：35-37.

[2]安健，劉月繁，汪明，等.柔嫩艾美耳球蟲的抗藥性調(diào)查[J］.中國獸醫(yī)雜志，2004，（6）：36-38.

[3]安健，汪明，韓春來，等.柔嫩艾美耳球蟲裂殖子的分離純化[J］.中國獸醫(yī)科技，2003，（12）：54-57.