微核試驗(yàn)方法及應(yīng)用研究進(jìn)展

陳　思，魯克慶，馬興銘

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)中心； 2.甘肅省泌尿系疾病臨床醫(yī)學(xué)中心；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,蘭州　730030)

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綜述與專論

微核試驗(yàn)方法及應(yīng)用研究進(jìn)展

陳思1,3，魯克慶2，馬興銘3

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)中心； 2.甘肅省泌尿系疾病臨床醫(yī)學(xué)中心；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,蘭州730030)

【摘要】微核(micronucleus,MN)試驗(yàn)，作為一種常規(guī)的基因毒性檢測(cè)方法，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。其檢測(cè)的標(biāo)本也從骨髓擴(kuò)展到血液和組織。除常規(guī)的藥物基因毒性檢測(cè)外，在基因改變性疾病的診斷，療效的評(píng)估和預(yù)防等方面具有重要的作用。另外，微核試驗(yàn)也是藥品，保健品注冊(cè)上市的安全檢測(cè)的一項(xiàng)重要的指標(biāo)。本文就目前的微核試驗(yàn)的染色方法以及疾病和病毒學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用加以綜述。

【關(guān)鍵詞】微核試驗(yàn)；基因毒；疾病

微核(micronucleus，MN)是一種獨(dú)立于主核之外的核小體，存在于細(xì)胞質(zhì)中，體積大約為主核的1/16到1/3，其染色與主核相一致，通過(guò)染色可以在光學(xué)顯微鏡下觀察到。微核的形成是由于基因組的不穩(wěn)定性和染色體的損傷有關(guān)。因此，可用于輔助診斷某些基因改變導(dǎo)致的疾病或遺傳病。腫瘤作為一種公認(rèn)的基因突變性疾病，它的治療、診斷和預(yù)防仍是醫(yī)學(xué)界的一大挑戰(zhàn)，MN可以作為一種生物標(biāo)記用來(lái)預(yù)測(cè)早期的癌前病變，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)人群進(jìn)行普查，具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1-3]。MN實(shí)驗(yàn)作為一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的基因毒性檢測(cè)方法，已成為遺傳毒性檢測(cè)的常規(guī)檢測(cè)手段。美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug administration，F(xiàn)DA)，歐洲藥監(jiān)局(European Medicines Agency, EMA)等部門均要求：基因毒性的檢測(cè)應(yīng)為藥物安全性評(píng)估的必須一部分[4]。微核試驗(yàn)也是我國(guó)藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則和國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求協(xié)調(diào)會(huì)(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH)新藥遺傳毒性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則共同推薦的遺傳毒性檢測(cè)方法之一。衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)和《食品安全毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法規(guī)范》中均要求保健食品和具有保健作用的藥品進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)時(shí)必須進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)的毒理學(xué)研究。

在過(guò)去的幾十年內(nèi)，微核試驗(yàn)的應(yīng)用不再局限于藥物的遺傳毒性的檢測(cè)，已擴(kuò)大到環(huán)境污染的檢測(cè)、臨床疾病的診斷和治療后的評(píng)估、病毒學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域，本文就目前微核試驗(yàn)的方法和微核試驗(yàn)的應(yīng)用加以綜述。

1微核形成的機(jī)制

MN的形成主要有兩種機(jī)制，一種是染色體的斷裂，另外一種是有絲分裂過(guò)程的紊亂[5]。當(dāng)正常的個(gè)體暴露于污染的環(huán)境，放射或服用致畸藥物和有毒化學(xué)物等條件下，均可促進(jìn)MN的形成。另外，慢性炎癥[6]、癌前病變[7, 8]、腫瘤[9]和一些其它的基因遺傳性疾病[10]均可以引起MN的增加。此外，病毒的感染也是MN形成的一個(gè)重要的原因。另外，使用抗著絲?？贵w可以是細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程紊亂，促進(jìn) MN的形成[11]。

2微核試驗(yàn)的方法

MN實(shí)驗(yàn)的取材可以是骨髓、組織上皮細(xì)胞、血液中的淋巴細(xì)胞。骨髓的取材一般適用于小鼠的微核試驗(yàn)，染毒方式一般有兩種：一是單劑量給藥后24~48 h內(nèi)取材；二是多次染毒，在最后一次給藥后18~24 h內(nèi)取材。給藥的方案應(yīng)超過(guò)1 d，計(jì)數(shù)大約2 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，觀察微核細(xì)胞的比例[11]。血液中淋巴細(xì)胞MN的檢測(cè)[12]，將采到的全血置于肝素抗凝管中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h，然后加入細(xì)胞松弛素-B后，對(duì)全血進(jìn)行染毒，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，離心去除上清液，然后加入0.075 mmol/L的KCl混勻后，加入1.5 mL固定液(甲醇和冰醋酸)，離心去除上清液，再次加入3 mL的固定液，離心去除上清液，將0.5 mL的固定液吹散后滴片，10%的Giemsa液染色10~15 min，晾干待測(cè)。組織中的微核試驗(yàn)檢[13]，將所需組織取出后，使用蛋白溶解酶(膠原酶)分離細(xì)胞，進(jìn)行染色，以小鼠的肝組織為例：將1 g左右的肝臟切碎，然后用100 U/mL的膠原酶分離肝細(xì)胞，分離后的肝細(xì)胞固定于4%的甲醛溶液固定液中，使用500 μg/mL吖啶橙或10%的4,6-二咪基-2-苯基吲哚進(jìn)行染色。歐洲替代試驗(yàn)有效性驗(yàn)證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)證實(shí)體外微核試驗(yàn)可以替代體外染色體畸變?cè)囼?yàn)用于遺傳毒性檢測(cè)[14]。近年來(lái)，自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)在體外微核試驗(yàn)中探索性應(yīng)用取得了進(jìn)步，已應(yīng)用于微核自動(dòng)化計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)[15]、計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)[16, 17]、激光掃描細(xì)胞儀[18]，高分辨率熒光細(xì)胞成像[19]檢測(cè)計(jì)數(shù)等，使體外微核試驗(yàn)操作更簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果更準(zhǔn)確、客觀。

3微核實(shí)驗(yàn)的方法評(píng)估

在細(xì)胞之中，胞質(zhì)中核小體的出現(xiàn)并不一定是微核細(xì)胞，它應(yīng)該與凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞細(xì)胞核溶解造成的MN相區(qū)別。微核細(xì)胞的特征包括：核小體的位置靠近主核，一般為細(xì)胞膜和細(xì)胞核中間的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；大小約為主核的1/16到1/3；染色與主核相一致或比主核染色更深；形態(tài)為圓形或橢圓形；MN的數(shù)量一般少于3個(gè)。另外，MN細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，主核清晰。凋亡的細(xì)胞細(xì)胞膜完整，無(wú)明顯的主核，核小體數(shù)量超過(guò)3個(gè)以上[5]。壞死細(xì)胞細(xì)胞膜不不完整，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)破壞，核小體出現(xiàn)于胞漿中，形態(tài)不規(guī)則。在進(jìn)行微核試驗(yàn)時(shí)，微核細(xì)胞的計(jì)數(shù)應(yīng)注意與壞死和凋亡的細(xì)胞相區(qū)別，以免造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4微核實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用

微核試驗(yàn)主要應(yīng)用于藥物的遺傳毒性檢測(cè)和環(huán)境中化學(xué)致畸物質(zhì)的檢測(cè)[20]。Cigerci等[21]使用微核試驗(yàn)的方法評(píng)估了氯化鈷(cobalt chloride, CoCl2)在環(huán)境污染中的危害，發(fā)現(xiàn)CoCl2能夠損傷DNA，造成染色體的斷裂。Valdiglesias等[22]比較了正常人與體弱人群之間外周血中微核細(xì)胞的比例差異，但結(jié)果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Recio等[23]檢測(cè)了乙基甲磺酸(ethylmethane sufonate, EMS)、丙烯酰胺(acrylamide, ACM)、環(huán)磷酰胺(cylophosphamide, CP)、長(zhǎng)春新堿(vincristine sulfate, VS)四中物質(zhì)在遺傳學(xué)中的作用，結(jié)果顯示在ACM、EMS、CP給藥之后微核細(xì)胞的比例升高，VS結(jié)果陰性。另外，在評(píng)估放射性遺傳物質(zhì)的損傷方面也有重要的作用。隨著基因組學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)許多疾病的發(fā)生與基因的突變，染色體的缺失或基因修復(fù)機(jī)制的受損有關(guān)，從基因水平上來(lái)尋找病因，診斷和監(jiān)控疾病。另外，在病毒學(xué)中，微核試驗(yàn)也是檢測(cè)病毒是否能夠?qū)е禄蛲蛔兊囊环N重要方法，能夠明確病毒是否具有基因毒性[24]，為某些病毒感染性疾病的預(yù)防提供指導(dǎo)。

4.1疾病的診斷和預(yù)防

4.1.1在腫瘤中的應(yīng)用：與正常的細(xì)胞和良性病變相比，惡性腫瘤的基因組不穩(wěn)定，基因修復(fù)機(jī)制受到損傷，突變率明顯增加[25]。將人子宮頸癌和正常的宮頸組織或炎性病變的組織相比，子宮頸癌組織中，微核細(xì)胞的比例明顯增加，并且不同級(jí)別的子宮頸癌，MN細(xì)胞的比例也有明顯的不同[26, 27]。另外，乳腺導(dǎo)管癌與乳腺的良性病變相比，MN細(xì)胞的比例存在明顯的差異，并且不同級(jí)別的乳腺導(dǎo)管癌，MN細(xì)胞的數(shù)量也存在明顯的不同[28]。Arora等[29]的研究表明在非典型尿路上皮癌中，MN的比例也明顯的提高。為此，MN可以作為尿路上皮癌的一種輔助性診斷方法。另外在癌前病變， MN的比例也明顯的增加[8]。為此，它可以作為癌前病變的一個(gè)篩查指標(biāo)。放療后，早期的MN的比例明顯的增加[30]，腫瘤進(jìn)行MN檢測(cè)時(shí)，應(yīng)在放射治療之前，以免造成數(shù)據(jù)的假陽(yáng)性。

4.1.2自身免疫性疾?。涸谧陨砻庖咝约膊≈?，自身抗體的產(chǎn)生扮演著重要的角色，它是檢測(cè)、診斷、評(píng)估和分類自身免疫性疾病的重要標(biāo)志，最新的研究表明：自身抗體可以誘發(fā)染色體的斷裂[26]。此外，在自身免疫性疾病中，慢性炎癥和氧化還原平衡的失調(diào)也發(fā)揮著重要的作用，它們也是誘發(fā)染色體斷裂，促進(jìn)MN形成的重要原因之一[31]。在器官組織特異性疾病之中，糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是最為典型的一種，在2007年的研究發(fā)現(xiàn)：與正常人相比，DM的病人血中淋巴細(xì)胞中MN比例的增加，與1型糖尿病相比，2型糖尿病中MN細(xì)胞的比例更高，但是給予葉酸30天后，MN的比例明顯的降低了[32]。在系統(tǒng)性組織特異性疾病中，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的病人，與正常人的口腔頰粘膜的細(xì)胞涂片分析中，MN細(xì)胞的比例也是升高的[33]。此外，Karaman等的研究表明在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的血中淋巴細(xì)胞MN的比例明顯增加[31]。因此，MN有可能成為自身免疫性疾病的輔助診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)控和療效評(píng)估的重要生物靶標(biāo)之一[34]。

4.2在病毒學(xué)中的應(yīng)用

MN實(shí)驗(yàn)在病毒學(xué)中，也具有廣泛的應(yīng)用，在EB病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，MN細(xì)胞的比例明顯的增加[35]。Cassel AP等人的研究發(fā)現(xiàn)HPV感染的女性患者，在子宮頸涂片和外周血中的MN的比例也是明顯增加的[36]，這可能與HPV產(chǎn)生的癌蛋白E6和E7的誘導(dǎo)相關(guān)[37]。

5展望

MN的形成并不一定是受到外界環(huán)境的刺激引起的，在生理情況下，也可產(chǎn)生，在各種實(shí)驗(yàn)之中已被證實(shí)。MN的形成也可能來(lái)源于細(xì)胞有絲分裂從G0到G1期過(guò)程之中，雙鏈DNA斷裂的生理性損傷，為此在正常的細(xì)胞之中，也可以出現(xiàn)MN，會(huì)造成一定的假陽(yáng)性率的出現(xiàn)，所以只有當(dāng)MN的比例明顯增加升高時(shí)，才能說(shuō)明存在基因毒性，另外微核試驗(yàn)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有準(zhǔn)確的定義，無(wú)比較精確的范圍，這是其重要的缺點(diǎn)之一。盡管如此，微核試驗(yàn)以其簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)廣泛的應(yīng)用于藥品基因毒性的檢測(cè)；多種自身疾病的輔助診斷、預(yù)防復(fù)發(fā)和療效的評(píng)估；惡性腫瘤和癌前病變輔助性的診斷；另外在環(huán)境污染和病毒學(xué)引起的染色體的突變的研究中，也廣泛應(yīng)用。

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〔修回日期〕2016-01-07

Research progress of the methods and applications of micronucleus assay

CHEN Si, LU Ke-qing, MA Xing-ming

(1.Department of Medical laboratory, Second Hospital of Lanzhou University, 2. Gansu Urological Clinical Center,3. School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730030, China)

【Abstract】Micronucleus (MN) assay as a routine examination for genotoxicity has been widely used. The testing specimens were taken from bone marrow and extended from blood and tissues. In addition to testing genotoxicity of drugs, it is also applied in disease diagnosis for genetic mutation, evaluation of curative effectiveness and disease prevention. Moreover, MN assay is also an important safety indicator for drugs and health foods registration. This review will discuss the staining method of MN test and its application in the field of diseases and virology.

【Key words】Micronucleus assay; Genotoxicity; Disease

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.017

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 02-0083-04

[作者簡(jiǎn)介]陳思(1977-)，女，在讀研究生，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。Email： lncsi@126.com。[通訊作者]馬興銘，教授，博導(dǎo)，主要從事醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究。Email： maxm@lzu.edu.cn。