關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測(cè)項(xiàng)目思考

佟　巍

( 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京　100021)

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關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測(cè)項(xiàng)目思考

佟巍

( 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京100021)

【摘要】通過(guò)多年的檢測(cè)實(shí)踐，筆者建議：① 我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置我國(guó)特有的“核心檢測(cè)項(xiàng)目”及“備選檢測(cè)項(xiàng)目”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。即：將現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)內(nèi)容設(shè)置為“核心檢測(cè)項(xiàng)目”，“核心檢測(cè)項(xiàng)目”中保留原有的“必檢項(xiàng)目”(即“●”)及“必要時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目”(即“○”)；將國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中未涉及的病毒檢測(cè)內(nèi)容設(shè)置為“備選檢測(cè)項(xiàng)”。②目前“核心檢測(cè)項(xiàng)目”中大鼠HV及小鼠Ect由“必檢項(xiàng)目”調(diào)整為“必要時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目”；大鼠增加對(duì)LCMV的檢測(cè)要求，設(shè)置為“必要時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目”；取消“核心檢測(cè)項(xiàng)目”中對(duì)TMEV病毒的檢測(cè)要求，將該病毒調(diào)整為“備選檢測(cè)項(xiàng)目”清單中。

【關(guān)鍵詞】實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；病毒學(xué)檢測(cè)

在生命科學(xué)研究迅猛發(fā)展的今天，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為最精密的實(shí)驗(yàn)“儀器”，其標(biāo)準(zhǔn)化要求顯得更為重要，并被世界范圍的科研工作者們所重視。

1國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)概況

生命科學(xué)研究深入發(fā)展同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量提出更高要求。一些發(fā)達(dá)國(guó)家及地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)建議實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和使用單位在制定健康監(jiān)測(cè)方案時(shí)不僅要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，而且還應(yīng)根據(jù)自身實(shí)際情況，制定個(gè)性化的健康監(jiān)測(cè)方案。

歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)聯(lián)合會(huì)(FELASA)每隔幾年更新一版最新的嚙齒類(lèi)、家兔繁殖和實(shí)驗(yàn)單元的健康監(jiān)測(cè)指導(dǎo)意見(jiàn)[1]。指導(dǎo)意見(jiàn)在全球范圍內(nèi)得到廣泛的使用，成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和使用單位健康監(jiān)測(cè)的行動(dòng)指南。該指導(dǎo)意見(jiàn)2014版涵蓋的病毒檢測(cè)項(xiàng)目小鼠19個(gè)、大鼠12個(gè)，具體見(jiàn)表1、表2[1]。FELASA強(qiáng)調(diào)其指導(dǎo)意見(jiàn)是健康監(jiān)測(cè)的最低要求。

美國(guó)Charles River是全球最有實(shí)力的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)提供商，其健康監(jiān)測(cè)理念具有很高的參考價(jià)值。目前該實(shí)驗(yàn)室健康監(jiān)測(cè)方案涉及病毒檢測(cè)項(xiàng)目小鼠18項(xiàng)，大鼠13項(xiàng)，具體見(jiàn)表1、表2。強(qiáng)調(diào)指出要根據(jù)實(shí)際情況制定適合的健康監(jiān)測(cè)方案[2]。

日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所(ICLAS)亦對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康檢測(cè)方案進(jìn)行了調(diào)整，將實(shí)驗(yàn)小鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目20種及大鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目12種，分為核心檢測(cè)項(xiàng)目(小鼠5種，包括：SV、Ect、LCMV、MHV、HV；大鼠3種，包括：SV、HV、SDAV。)和備選的檢測(cè)項(xiàng)目(小鼠13種，包括：Mad(FL)、Mad(K87)、GD7/TMEV、MVM、PVM、Reo-3、EDIM、KV、mouse cytomegalovirus、MPV、MTLV、MNV、POLY；大鼠9種，包括：Mad(FL)、Mad(K87)、GD7、MVM、PVM、Reo-3、H-1、KRV、RPV)。他們還將感染性病原分為A、B、C、D、E五類(lèi)，涉及病毒的有三類(lèi)：A人獸共患病，2種(LCMV、HV)；B實(shí)驗(yàn)動(dòng)物烈性傳染病，3種(Ect、MHV、SV)；C隱性感染性疾病，15種(EDIM/Rota、LDHV、MAd、MCMV、GD7/TMEV、MNV、POLY、PVM、Reo-3、MVM、KRV、H-1、MPV、RPV、SDAV)。檢測(cè)內(nèi)容基本涵蓋了Charles River Laboratories的病毒檢測(cè)內(nèi)容。還有其他國(guó)家及地區(qū)檢測(cè)清單中沒(méi)有的檢測(cè)項(xiàng)目(鼠星狀病毒murine astrovirus)。(http://www.iclasmonic.jp/microbiology/inspection/mouse.html)

我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB14922.2-2011)規(guī)定實(shí)驗(yàn)小鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目11種，其中必檢項(xiàng)目6種(Ect、MHV、SV、PVM、Reo-3、MVM)，必要時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目5種(LCMV、HV、GD7/TMEV、MAd、POLY)；大鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目8種(HV、SV、PVM、Reo-3、H-1/KRV、RCV/SDAV)，全部為必檢項(xiàng)目[3]。

表1　國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)小鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目

表2　國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)大鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目

2病毒病原對(duì)動(dòng)物健康及實(shí)驗(yàn)研究的影響

早在1991年美國(guó)《Biology and Life Sciences - Lab Animal Research》就不同感染性疾病對(duì)實(shí)驗(yàn)研究帶來(lái)的影響進(jìn)行了闡述。1998年美國(guó)《Clinical Microbiology Reviews》亦對(duì)同樣問(wèn)題進(jìn)行了論述。他們均就不同病原對(duì)動(dòng)物機(jī)體功能系統(tǒng)帶來(lái)的危害進(jìn)行了詳盡說(shuō)明[4-6]。見(jiàn)表3。

2.1呼吸系統(tǒng)疾病是小鼠、大鼠最常見(jiàn)健康問(wèn)題

實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠呼吸道病毒病原為SV、PVM、RCV、KV。常為隱性感染導(dǎo)致亞臨床癥狀，實(shí)驗(yàn)條件下也可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。通常與其它病原微生物合并感染后導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸道疾病。SV感染易感小鼠或免疫缺陷鼠可導(dǎo)致疾病甚至死亡，是重要的實(shí)驗(yàn)鼠群的病毒性傳染病之一，干擾生理、病理、免疫學(xué)及腫瘤學(xué)方面的研究；PVM是重要的呼吸道病毒，自然條件下可感染實(shí)驗(yàn)鼠，對(duì)免疫缺陷鼠具有致病性，主要干擾生理、病理及腫瘤學(xué)方面的研究；RCV是感染率最高以及嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)，胸腺缺如大鼠更為易感；KV實(shí)驗(yàn)小鼠中較為少見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)感染裸鼠可致病。

2.2消化系統(tǒng)疾病在小鼠和大鼠中極為常見(jiàn)

乳鼠或幼鼠感染病原體會(huì)對(duì)消化系統(tǒng)帶來(lái)最嚴(yán)重的影響，產(chǎn)生明顯的臨床癥狀。當(dāng)它們離乳或剛剛成年后臨床癥狀可能已不存在，也可能出現(xiàn)更加明顯消化道疾病臨床癥狀(例如腹瀉和生長(zhǎng)阻滯)而未被發(fā)現(xiàn)。這些病毒病原包括：MCMV、RCMV、MPV、MTV、SDAV、MHV、MRV/ EDIM、RRV、Reo-3、Adenoviruses等。SDAV、MHV成年鼠常為隱性感染，新生鼠感染死亡率極高，是感染率最高以及嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)的病原體，干擾腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、生理學(xué)及生殖技術(shù)方面的實(shí)驗(yàn)研究；MRV/ EDIM只對(duì)新生小鼠致??；大鼠感染Reo-3非常少見(jiàn)，一旦感染可能會(huì)干擾腫瘤移植和利用這些動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的體外試驗(yàn)；曾有RRV感染導(dǎo)致消化系統(tǒng)疾病的報(bào)道；RCMV感染在實(shí)驗(yàn)鼠中極為罕見(jiàn)，野生鼠中較為常見(jiàn)，可以通過(guò)潛伏感染大鼠器官移植轉(zhuǎn)移到受體大鼠器官；MTV可通過(guò)亞臨床感染小鼠組織感染幼鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)造成復(fù)雜的影響；MCMV未見(jiàn)自然感染報(bào)道，實(shí)驗(yàn)接種該病毒可引起嚴(yán)重干擾免疫反應(yīng)；MPV是感染實(shí)驗(yàn)小鼠非常重要的病原體之一，病毒感染免疫活性的小鼠后病毒可在胰腺、小腸淋巴器官,肝臟中復(fù)制，并可能持續(xù)幾個(gè)星期，病毒感染免疫缺陷小鼠后病毒可在機(jī)體內(nèi)廣泛存在；腺病毒(adenoviruses)包括K87及FL株(也稱(chēng)為MAd-1及MAd-2)，MAd-1感染可對(duì)成年小鼠造成廣泛持久的病變。

2.3皮膚和關(guān)節(jié)異常在實(shí)驗(yàn)鼠群中較為常見(jiàn)

可造成實(shí)驗(yàn)鼠皮膚和關(guān)節(jié)異常的病毒病原有：Ect、RPV、mouse papule virus和MMTV。Ect感染常為亞臨床活動(dòng)性，易感動(dòng)物感染幾乎全部死亡，是重要的小鼠烈性傳染病，污染的動(dòng)物組織及生物制品是實(shí)驗(yàn)室間傳播的主要方式；RPV實(shí)驗(yàn)鼠群中較少見(jiàn)，可隱性感染，易感動(dòng)物感染死亡率幾乎50%，大鼠感染可造成肺、皮膚、肺及皮膚三種類(lèi)型的損害；Mouse papule virus患病小鼠在腳和尾巴出現(xiàn)中央縮進(jìn)或類(lèi)似酒窩的丘疹，患處水腫和充血，皮膚損傷類(lèi)似的鼠痘；MMTV高度致癌，是導(dǎo)致小鼠乳腺瘤的病毒。

2.4某些病原將機(jī)體的造血系統(tǒng)作為它們的主要目標(biāo)組織

它們包括：LCMV、LDHV、MuLVs。LCMV是非常重要的人畜共患傳染病病原，盡管傳統(tǒng)被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要病原體，實(shí)際上該病原主要損害的是機(jī)體的造血系統(tǒng)，主要影響免疫學(xué)、生理學(xué)和生理機(jī)能方面的研究；LDHV是小鼠腫瘤組織的常見(jiàn)污染物，感染鼠血清乳酸酶可增加5～10倍；MuLVs是一群基因相關(guān)的病毒被統(tǒng)稱(chēng)為小鼠白血病病毒，許多近交系小鼠敏感，與腫瘤發(fā)生相關(guān)。

2.5影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病毒是TMEV/GD7

少有自然感染，實(shí)驗(yàn)鼠感染該病毒出現(xiàn)類(lèi)似人類(lèi)感染脊髓灰質(zhì)炎病毒的表現(xiàn)。

2.6對(duì)機(jī)體多系統(tǒng)造成損害的病毒病原有：KRV、H-1、MVM、MHV、POLY、HV、SDAV、MNV

KRV及H-1是細(xì)胞及生物制品的常見(jiàn)污染物，很少有自然感染，感染可能會(huì)干擾胎兒發(fā)育導(dǎo)致畸形發(fā)生；MVM在小鼠中流行較為廣泛，是移植腫瘤及敏感動(dòng)物細(xì)胞系的常見(jiàn)污染物，感染對(duì)于大多數(shù)的研究幾乎沒(méi)有意義，但對(duì)小鼠移植腫瘤、白血病和體外免疫測(cè)定等研究非常重要。常會(huì)干擾病理學(xué)、免疫學(xué)、生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育學(xué)及腫瘤學(xué)等方面的研究；POLY也是移植腫瘤及細(xì)胞系的常見(jiàn)污染物，自然感染免疫正常鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)影響可能較小，沒(méi)有POLY污染的鼠群一旦感染新生鼠可引起腫瘤廣泛分布造成免疫力低下從而影響實(shí)驗(yàn)；HV是最重要的人畜共患病之一，可造成實(shí)驗(yàn)大鼠持久的亞臨床感染，導(dǎo)致嚴(yán)重疾??；MNV在實(shí)驗(yàn)鼠群中感染率較高，免疫健全小鼠感染不引起臨床癥狀，一些品系的免疫缺陷鼠可引起感言、間質(zhì)性肺炎、腦炎等，從而影響實(shí)驗(yàn)。

3關(guān)于健康檢測(cè)計(jì)劃的制定

似乎制定更為全面的健康監(jiān)測(cè)方案，采用更嚴(yán)格的微生物控制水平，才是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性的重要保證。然而在實(shí)際工作中，經(jīng)濟(jì)成本、可操作性以及對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然狀態(tài)模擬等因素是必須考慮的問(wèn)題。因此，采用最嚴(yán)格的微生物控制水平排除所有病原，使用最高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物并不一定是最適合的[7、8]。

對(duì)于動(dòng)物飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)來(lái)說(shuō)，采用最嚴(yán)格的控制措施的確會(huì)浪費(fèi)很多資源。實(shí)際上，有些病原體是相當(dāng)難以清除的，一些動(dòng)物設(shè)施實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠群中存在一種或幾種病原感染的現(xiàn)象，所以徹底消除這些病原體是不現(xiàn)實(shí)的，應(yīng)優(yōu)先消除人獸共患病、動(dòng)物烈性傳染病以及對(duì)研究數(shù)據(jù)影響較大的病原體。并且，在有可能根除某病原時(shí)對(duì)其監(jiān)測(cè)才有意義[7、8]。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用者來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)方案應(yīng)根據(jù)研究目的來(lái)制定，不同類(lèi)型的科研項(xiàng)目不應(yīng)使用同一種健康監(jiān)測(cè)方案。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)首先該考慮研究項(xiàng)目需要選擇何種級(jí)別的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，還要考慮需排除哪些可能干擾實(shí)驗(yàn)的其它病原以及實(shí)驗(yàn)設(shè)施或本地區(qū)的病原流行情況，才能制定更為科學(xué)的健康檢測(cè)及監(jiān)測(cè)方案[7、8]。

4對(duì)現(xiàn)行國(guó)標(biāo)檢測(cè)項(xiàng)目的建議

目前，我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB14922.2-2011)病毒檢測(cè)與歐美日等國(guó)家和地區(qū)相比，涉及的檢測(cè)項(xiàng)目相對(duì)較少，一些新興的影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的傳染性病原未能涉及。

筆者建議，設(shè)置我國(guó)特有的核心檢測(cè)項(xiàng)目(包括人獸共患病及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物烈性傳染病，為最低檢測(cè)要求)及“備選檢測(cè)項(xiàng)目”(主要是隱性感染性病原，根據(jù)需要進(jìn)行選擇)。借鑒這樣的分類(lèi)方法既便于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工作者識(shí)別病原危害程度及可能存在潛在影響的因素，設(shè)計(jì)出符合實(shí)際需要的健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃，又可為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物商品化、國(guó)際化以及科研信息的交流提供必要的保障。“備選檢測(cè)項(xiàng)目”可根據(jù)需要從中選擇，不做強(qiáng)制要求?！皞溥x檢測(cè)項(xiàng)目”應(yīng)包含盡可能多的檢測(cè)內(nèi)容，提供更為廣泛的健康監(jiān)測(cè)范圍，最大程度地滿(mǎn)足不同實(shí)驗(yàn)需要。

表3　影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠、大鼠質(zhì)量的病毒病原

備注：*存在感染的可能；**敏感；

另外，通過(guò)回顧十余年來(lái)我實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中心對(duì)二十余家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及使用單位的大鼠、小鼠活體及血清樣本的檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)查閱十余年來(lái)我國(guó)部分檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的大鼠、小鼠病毒檢測(cè)報(bào)告，發(fā)現(xiàn)大鼠HV病毒、小鼠Ect病毒、GD7/TMEV病毒抗體檢出率呈極低水平或未曾檢出，在普通實(shí)驗(yàn)大鼠血清樣品抽查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有人獸共患病LCMV病毒的檢出[9]。

綜上所述，作者建議實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中，調(diào)整大鼠HV及小鼠Ect由“必檢項(xiàng)目”(即“●”)調(diào)整為“必要時(shí)檢測(cè)的項(xiàng)目”(即“○”)；在大鼠“核心檢測(cè)項(xiàng)目”清單中增加對(duì)LCMV的檢測(cè)要求，設(shè)置為“必要時(shí)檢測(cè)項(xiàng)目”(即，“○”)；取消對(duì)TMEV病毒的檢測(cè)要求，將該病毒列至“備選檢測(cè)項(xiàng)目”清單中。見(jiàn)表4、表5。

表4　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠、小鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目之——核心檢測(cè)項(xiàng)目

表5　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠、小鼠病毒檢測(cè)項(xiàng)目之——備選檢測(cè)項(xiàng)目

注：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇需要排除的病毒病原。備注：表格中“▲”的檢測(cè)項(xiàng)目為日本ICLAS、美國(guó)Charles River Laboratories、歐洲FELASA沒(méi)有列出的檢測(cè)項(xiàng)目。

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〔修回日期〕2015-12-27

Consideration of the virological items in the National Standard of Laboratory Animals

TONG Wei

(Institute of Laboratory Animals, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100021，China)

【Abstract】Based on the practice in laboratory animal monitoring, the following issues are suggested: (1) The core items and candidate items should be separated in the National Standard; (2) Hantaan virus and Ect virus should be omitted in the core list for mice; LCMV should be monitored as a candidate item for rats; TMEV should be listed as candidate item.

【Key words】Laboratory animals, Virological monitoring

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.009

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 02-0042-06

[通訊作者]佟巍(1972-)，女，主管技師，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)免疫學(xué)。E-mail： twtongwei@sina.com。

“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)論壇”專(zhuān)題