Toll樣受體4與乙型肝炎病毒感染研究進展①

燕　飛　朱堅勝

(浙江省臺州醫(yī)院感染科，臨海317000)

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Toll樣受體4與乙型肝炎病毒感染研究進展①

燕飛朱堅勝

(浙江省臺州醫(yī)院感染科，臨海317000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是嚴重威脅人類健康問題之一，全球約3.5億慢性HBV攜帶者，每年大約有60萬人死于急性、慢性HBV感染[1]。我國慢性HBV感染者主要來自圍產(chǎn)期和嬰幼兒時期的感染，由于免疫系統(tǒng)不健全，多數(shù)發(fā)展為慢性感染，是引起肝硬化、肝癌的主要原因之一[2]。HBV感染后，機體通過細胞毒性T淋巴細胞反應殺死或抑制感染細胞內的病毒復制，控制HBV感染[3]。目前認為機體針對HBV免疫反應不足是導致病毒持續(xù)感染的主要原因。機體免疫系統(tǒng)包括固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)，固有免疫系統(tǒng)在病原微生物侵入時給予最快的防御。模式識別受體(Pathogen recognition receptors，PRR)是參與固有免疫重要的一種結構，識別病原微生物的病原相關模式分子(Pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)和宿主凋亡細胞表面的損傷相關模式分子(Damage-associated molecular pattern，DAMPs) ，并提呈給淋巴細胞，在機體固有免疫和特異性免疫中起重要作用[4]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)就是PRRs家族中的最重要的一類受體，是哺乳動物和昆蟲體內一類進化上保守的病原體識別結構，通過識別細菌、真菌、原生動物和病毒等病原體相關的微生物結構(如糖類、脂類、多肽及核苷酸等)在固有免疫中發(fā)揮重要作用[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)13種哺乳動物TLRs，其中TLR4是在哺乳類中最早發(fā)現(xiàn)的TLR，在機體免疫系統(tǒng)中起重要作用[6]。

1TLR4表達、受體及結構

TLR4由一個富含亮氨酸重復序列(Leucine-rich repeats，LRRs)結構的胞外域、一個跨膜域和Toll/IL-1受體(Toll/interleukin-1 receptor,TIR)同源結構的胞內域組成[7]，胞外區(qū)負責識別不同病原分子，胞內區(qū)負責受體活化后的信號轉導，激發(fā)機體免疫反應。TLR4廣泛表達在各種細胞表面，既包括非特異性免疫細胞，比如單核細胞、成熟巨噬細胞、樹突狀細胞、肥大細胞等，也包括特異性免疫細胞T淋巴細胞，B淋巴細胞等[8]。TLR4信號通路不僅可被PAMPs激活，也可被組織損傷和炎癥過程中產(chǎn)生的內源性配體激活。外源性配體包括革蘭陰性菌產(chǎn)生的脂多糖(Lipopolysacharide，LPS)、真菌的甘露聚糖、結核分枝桿菌的可溶性成分，而內源性配體包括熱休克蛋白60、熱休克蛋白70、纖維蛋白原等[6]。特異性配體結合TLR4胞外域后，TLR4通過依賴MyD88途徑和非依賴MyD88途徑兩條途徑激活下游信號通路[9]。

2TLR4信號通路

1.1MyD88依賴性信號轉導TLR4和配體結合后，通過胞內TIR結構域結合MyD88，募集白細胞介素受體相關激酶1和4(IL receptor-associated kinase ，IRAK1和4)，激活腫瘤壞死因子受體活化因子6(Tumor necrosis factor receptor activated factor 6，TRAF6)，形成IRAK-4/IRAK-1/TRAF6復合體，激活IκB激酶(IKK)和絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)，引起絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB激活[10]，調控細胞因子如(IL-1、IL-6、TNF-α、 IL-10、 IL -12等)和其他靶基因的表達[11,12]。

1.2MyD88非依賴性信號轉導TLR4胞內結構域可以不結合MyD88，而是通過和含TIR結構域且誘導干擾素-β(IFN-β)(TIR-domain-containing adaptor protein inducing IFN-β,TRIF)的接頭蛋白結合，TRIF激活TBK1和介導的轉錄因子干擾素調節(jié)因子3的磷酸化，激活MAPK和NF-κB[9]，促進下游干擾素等分泌[13]。

3TLR4的免疫調節(jié)性與HBV感染

免疫因素在病毒性肝炎的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。TLR4信號能募集活化自然殺傷細胞和樹突狀細胞、單核細胞等，通過TLR4對抗原進行捕獲、加工處理后提呈給組織相容性復合物Ⅰ、Ⅱ類分子，從而誘導T淋巴細胞分化、增殖，調節(jié)機體的免疫反應。有研究表明長期HBV感染者不能激發(fā)適當?shù)拿庖叻磻宄《緦е鲁掷m(xù)感染[14,15]。John等[16]證實TLR4在感染HBV的肝臟中激活針對HBV的CD8+T 淋巴細胞的免疫反應中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)的HBV的感染可以抑制TLR4的表達及功能。慢性HBV感染者外周血單個核細胞的TLR4 mRNA表達明顯減少[17,18]，HBV在患者體內復制活躍、病毒載量增高與外周血單個核細胞TLR4 mRNA的表達下調有關[18]。Wei等[19]也發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染患者肝細胞內TLR4表達下降。阮萍等[20]研究提示枯否細胞的TLR4可能通過影響枯否細胞功能而參與樹鼩HBV感染后肝臟病變的慢性化發(fā)展過程。Wu等[21,22]將肝細胞和肝臟非實質細胞與HBV轉基因小鼠細胞培養(yǎng)上清、HBsAg、HBeAg或者HBV病毒共培養(yǎng)后，調節(jié)干擾素分泌的信號通路蛋白干擾素調節(jié)因子3(IRF-3)、NF-κB、細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK 1/2)表達下降，IFN-β分泌減少，TLR4產(chǎn)生的抗病毒作用消失；提高HBV滴度后，IRF-3表達下降，TNF-α、IL-6分泌減少；通過siRNA抑制HBV復制后，IRF-3、NF-κB、ERK 1/2蛋白表達及炎癥因子分泌增加。Heiberg等[23]研究發(fā)現(xiàn)使用TLR4特異性配體刺激后，慢性HBV感染者分泌IFN-α較健康者少?？梢婇L期感染HBV的患者TLR4的表達和信號通路受到影響，TLR4在HBV的感染過程中起重要作用。既然HBV抑制了TLR4的表達及功能，如果加入特異性配體激活TLR4后，是否能產(chǎn)生抗HBV的作用呢？進一步研究發(fā)現(xiàn)通過加入外源性TLR4的特異性配體，可激活TLR4，并促進下游炎癥因子的分泌等免疫功能[21]。同時也有另外一些研究表明TLR4及相應特異性配體可以激活針對HBV的免疫反應。Isogawa等[24]發(fā)現(xiàn)，向HBV轉基因小鼠靜脈注射TLR4特異性的配體，可激活IFN-α/β依賴信號通路抑制HBV的復制。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)TLR4配體LPS能激活土撥鼠肝炎病毒感染的肝細胞的 NF-κB,及MAPK,PI-3 k/Akt，使用這些信號通路的阻斷劑阻斷后，LPS激活的抗病毒效應消失。Zhou等[26]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)在HBV相關性腎炎中較原發(fā)性腎小球腎炎腎小管中TLR4表達高，并且和HBsAg分布相似，體外實驗將HBV相關性腎炎血清與HK2細胞培養(yǎng)，TLR4表達較健康者增加，加入LPS激活TLR4后，HBV-DNA、HBsAg及HbeAg滴度下降;上調近段膽管上皮細胞TLR4的表達后，乙肝病毒分泌的抗原和HBV-DNA載量下降。此外Lu等[27]發(fā)現(xiàn)隨著HBV感染患者疾病逐漸進展，樹突狀細胞的數(shù)量逐漸減少，TLR2、TLR4表達明顯增加，二者呈正相關，提示外周血中樹突狀細胞表面TLR2/4協(xié)同表達可能促進HBV感染后的疾病進展。Xing等[28]實驗證明肝硬化和急性肝衰竭患者單核細胞表面TLR4表達較健康對照組上調。因此,TLR4的激活不僅參與誘導免疫反應的誘導,也參與慢性乙型肝炎并發(fā)癥的形成。

根據(jù)目前的研究可以得出慢性乙肝患者針對HBV的特異性免疫應答減弱，TLR4在慢性乙肝感染患者體內表達下降,HBV可抑制TLR4下游信號通路蛋白的表達及激活，從而影響機體的免疫功能，可能是HBV持續(xù)感染的因素之一。目前許多研究轉向生物疫苗研究。Farag等[29]在體外將DC負載HBV亞病毒顆粒，TLR4特異性受體LPS體外激活樹突狀細胞后，導入HBV轉基因小鼠后，轉基因小鼠體內產(chǎn)生HBV特異性抗體和T細胞反應，雖然HBV抗原水平及病毒載量無明顯變化，但可以打破免疫耐受，激活體內免疫反應。但是也有研究發(fā)現(xiàn)LPS激活TLR4后導致調節(jié)性T細胞表達增多，引起機體對HBV相關抗原的免疫耐受[30]。Chung等[31]使用 TLR4特異性配體(LPS)刺激慢性HBV感染者外周血單核細胞后，分泌細胞因子IL-6及IL-8較健康者無明顯變化。是否可通過提高激活TLR4及其信號通路蛋白來增強機體對HBV的免疫反應，尋找治療HBV慢性感染的靶蛋白，仍需進一步研究，更多使用TLR4受體激動劑作為佐劑的研究可以提高我們對TLR4及其信號通路在抑制HBV的免疫反應中的作用的認識。這些結果的不一致可能與TLR4基因多態(tài)性有關。

4TLR4的單核苷酸多態(tài)性與HBV感染

TLRs的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)、相關連接分子及細胞因子分泌都可以改變機體免疫反應。在感染HCV的高加索人中發(fā)現(xiàn)TLR的單個核苷酸多態(tài)性影響疾病的臨床轉歸[32]。TLR4的SNPs 可能影響機體對入侵的病毒、細菌等病原體的免疫反應，人類TLR4的SNP位點大約有100多個，其中T399I 和D299G 位點是TLR4胞外域蛋白中最常見的，這些SNPs可能影響LPS的識別及與其他共刺激分子的連接[33,34]。Cussigh等[35]發(fā)現(xiàn)TLR4 rs4986790 A/A是白種人慢性HBV感染者預后不佳的一個影響因素，可能和男性性別相互協(xié)同。Wu等[36]發(fā)現(xiàn)在中國慢性乙肝患者中，G等位基因攜帶者TLR4基因rs4986790位點多態(tài)性(Asp299Gly)與HBsAg的血清學轉換及清除明顯相關。Zhou等[37]發(fā)現(xiàn)TLR4基因rs11536889位點多態(tài)性在肝移植后HBV復發(fā)中起重要作用，具有C-C和C-G基因型的肝移植后不易出現(xiàn)HBV感染復發(fā)，而C-C基因型的較易出現(xiàn)HBV感染復發(fā)。但SNP對HBV急性或慢性感染中的作用仍不清楚，SNP位點對TLR4信號通路激活，包括下游通路的激活、炎癥因子的分泌影響還需進一步研究，明確這些單核苷酸多態(tài)性對免疫的影響。

5其他

95%的成年人在感染乙型肝炎病毒后，會在幾周時間內清除病毒。然而，90%新生兒和1～5歲兒童約30%感染肝炎病毒后卻無法清除，并發(fā)展成慢性感染，是肝硬化及肝癌的高危因素，可見HBV的感染獨特的一個特點就是病毒被清除過程和年齡是密切相關的，但是原因仍不清楚。HBV宮內感染是我國攜帶者和慢性乙型肝炎發(fā)生的傳播途徑，資捷等[38]體外LPS刺激人類滋養(yǎng)細胞來源的細胞系Bewo細胞，可顯著誘導TLR4 mRNA表達及抑制HBV-DNA復制、HBsAg及HBeAg表達，抑制TLR4后可逆轉LPS對HBV復制的抑制作用，可見激活TLR4可抑制Bewo細胞中HBV復制。有研究發(fā)現(xiàn)LPS體外刺激HBV宮內感染孕婦的臍血單核細胞TLR4表達增強，分泌Th1型細胞因子IFN-γ增加，且TLR4表達與LPS呈正相關，IFN-γ的水平與TLR4表達呈正相關，IL-4水平與TLR4呈負相關，因此LPS可能通過影響TLR4信號傳導通路誘導臍血單個核細胞分泌不同細胞因子，選擇性調控Th1/Th2型應答[39]。以上研究表明在人類滋養(yǎng)細胞及臍血單核細胞中激活TLR4可抑制HBV-DNA的復制，促進促炎因子的產(chǎn)生，調控Th1/Th2型應答，為阻斷宮內HBV感染提供了一個研究方向。

Chou等[40]通過轉染HBV小鼠模型發(fā)現(xiàn)腸道菌群是年齡影響HBV清除的原因。C3H/HeN成年感染小鼠可快速清除乙肝病毒，但是在相同品系的幼年小鼠無法清除病毒；使用抗生素清除小鼠腸道菌群后，成年小鼠感染HBV后無法快速清除HBV；破壞TLR4信號通路后，成年小鼠和幼年小鼠均能清除HBV，提示腸道菌群可能通過影響激活TLR4信號通路引起免疫耐受，但腸道菌群是否通過促進TLR4分泌IL-10，引起免疫耐受，還是與小鼠基因型有關進而影響HBV的清除，仍需進一步研究。這些研究為探討乙型肝炎感染的預防和治療，提供了有益的線索。

6展望

綜上所述，TLR4及其信號轉導在HBV感染過程中起重要作用，但目前HBV持續(xù)感染的具體機制仍不十分清楚，如何打破免疫耐受仍是個難題。因為TLR4在HBV感染者體內不同細胞表面表達變化趨勢不同，對相應細胞功能影響不同，如在單核細胞上表達下降，使其抗乙肝病毒作用受到抑制，但在調節(jié)性T細胞上卻表達上調，增強了調節(jié)性T細胞的抑制功能，因此如何靶向調節(jié)TLR4及其信號通路的表達都尚不清楚，以及藥物調節(jié)TLR4信號轉導的利弊權衡仍需進一步研究?，F(xiàn)在人工合成的TLR4的激動劑可有激活機體的保護性免疫反應，利用TLR4的配體或激動劑可能成為打破HBV患者免疫耐受狀態(tài)的一種治療方法。TLR4的單核苷酸多態(tài)性對其激活及下游信號通路、炎癥因子分泌的影響仍不清楚。這些問題的深入研究對進一步明確HBV慢性感染的免疫機制有重要意義，并可望為HBV感染治療提供新的思路。

參考文獻：

[1]Te HS,Jensen DM.Epidemiology of hepatitis B and C viruses:a global overview[J].Clin Liver Dis,2010,14(1):1-21.

[2]Lim CY,Kowdley KV.Optimal duration of therapy in HBV-related cirrhosis[J].J Antimicrob Chemother,2007,60(1):2-6.

[3]Bertoletti A,Gehring AJ.The immune response during hepatitis B virus infection[J].J Gen Virol,2006,87(Pt 6):1439-1449.

[4]Masci AM,Arighi CN,Diehl AD,etal.An improved ontological representation of dendritic cells as a paradigm for all cell types[J].BMC Bioinformatics,2009,10:70.

[5]Janeway CJ,Medzhitov R.Innate immune recognition[J].Annu Rev Immunol,2002,20:197-216.

[6]Lien E,Ingalls RR.Toll-like receptors[J].Crit Care Med,2002,30(1 Supp):S1-S11.

[7]Noreen M,Shah MA,Mall SM,etal.TLR4 polymorphisms and disease susceptibility[J].Inflamm Res,2012，61(3)：177-188.

[8]Hennessy EJ,Parker AE,O′Neill LA.Targeting Toll-like receptors:emerging therapeutics?[J].Nat Rev Drug Discov,2010,9(4):293-307.

[9]Guo J,Friedman SL.Toll-like receptor 4 signaling in liver injury and hepatic fibrogenesis[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2010,3:21.

[10]Kaisho T,Akira S.Toll-like receptor function and signaling[J].J Allergy Clin Immunol,2006,117(5):979-987,988.

[11]Kawai T,Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol,2010,11(5):373-384.

[12]Akira S,Uematsu S,Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell,2006,124(4):783-801.

[13]Yamamoto M,Sato S,Hemmi H,etal.Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway[J].Science,2003,301(5633):640-643.

[14]Arababadi MK,Nasiri AB,Kennedy D.Current information on the immunologic status of occult hepatitis B infection[J].Transfusion,2012,52(8):1819-1826.

[15]Sajadi SM,Mirzaei V,Hassanshahi G,etal.Decreased expressions of Toll-like receptor 9 and its signaling molecules in chronic hepatitis B virus-infected patients[J].Arch Pathol Lab Med,2013,137(11):1674-1679.

[16]John B,Crispe IN.TLR-4 regulates CD8+T cell trapping in the liver[J].J Immunol,2005,175(3):1643-1650.

[17]Chen Z,Cheng Y,Xu Y,etal.Expression profiles and function of Toll-like receptors 2 and 4 in peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis B patients[J].Clin Immunol,2008,128(3):400-408.

[18]李春江，孫蕾，張敬凱,等.HBV感染者外周血PBMC中TLR4 mRNA與病毒載量的相關性研究[J].中國微生態(tài)學雜志,2009,21(7):633-635.

[19]Wei XQ,Guo YW,Liu JJ,etal.The significance of Toll-like receptor 4 (TLR4) expression in patients with chronic hepatitis B[J].Clin Invest Med,2008,31(3):E123-E130.

[20]Ruan P,Yang C,Su J,etal.Expressions and significance of TLR2 and TLR4 in Kupffer cells of tree shrews chronically infected with hepatitis B virus[J].Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi,2014,30(7):686-690.

[21]Wu J,Meng Z,Jiang M,etal.Hepatitis B virus suppresses toll-like receptor-mediated innate immune responses in murine parenchymal and nonparenchymal liver cells[J].Hepatology,2009,49(4):1132-1140.

[21]Wu J,Lu M,Meng Z,etal.Toll-like receptor-mediated control of HBV replication by nonparenchymal liver cells in mice[J].Hepatology,2007,46(6):1769-1778.

[23]Heiberg IL,Winther TN,Paludan SR,etal.Pattern recognition receptor responses in children with chronic hepatitis B virus infection[J].J Clin Virol,2012,54(3):229-234.

[24]Isogawa M,Robek MD,Furuichi Y,etal.Toll-like receptor signaling inhibits hepatitis B virus replication in vivo[J].J Virol,2005,79(11):7269-7272.

[25]Zhang X,Meng Z,Qiu S,etal.Lipopolysaccharide-induced innate immune responses in primary hepatocytes downregulates woodchuck hepatitis virus replication via interferon-independent pathways[J].Cell Microbiol,2009,11(11):1624-1637.

[26]Zhou Y,Zhu N,Wang X,etal.The role of the toll-like receptor TLR4 in hepatitis B virus-associated glomerulonephritis[J].Arch Virol,2013,158(2):425-433.

[27]Lu X,Xu Q,Bu X,etal.Relationship between expression of toll-like receptors 2/4 in dendritic cells and chronic hepatitis B virus infection[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):6048-6055.

[28]Xing T,Li L,Cao H,etal.Altered immune function of monocytes in different stages of patients with acute on chronic liver failure[J].Clin Exp Immunol,2007,147(1):184-188.

[29]Farag MM,Tedjokusumo R,Flechtenmacher C,etal.Immune tolerance against HBV can be overcome in HBV transgenic mice by immunization with dendritic cells pulsed by HBVsvp[J].Vaccine,2012,30(42):6034-6039.

[30]Zhang Y,Lian JQ,Huang CX,etal.Overexpression of Toll-like receptor 2/4 on monocytes modulates the activities of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in chronic hepatitis B virus infection[J].Virology,2010,397(1):34-42.

[31]Chung H,Watanabe T,Kudo M,etal.Correlation between hyporesponsiveness to Toll-like receptor ligands and liver dysfunction in patients with chronic hepatitis C virus infection[J].J Viral Hepat,2011,18(10):e561-e567.

[32]Sawhney R,Visvanathan K.Polymorphisms of toll-like receptors and their pathways in viral hepatitis[J].Antivir Ther,2011,16(4):443-458.

[33]Arbour NC,Lorenz E,Schutte BC,etal.TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans[J].Nat Genet,2000,25(2):187-191.

[34]Rallabhandi P,Bell J,Boukhvalova MS,etal.Analysis of TLR4 polymorphic variants:new insights into TLR4/MD-2/CD14 stoichiometry,structure,and signaling[J].J Immunol,2006,177(1):322-332.

[35]Cussigh A,Fabris C,Fattovich G,etal.Toll like receptor 4 D299G associates with disease progression in Caucasian patients with chronic HBV infection:relationship with gender[J].J Clin Immunol,2013,33(2):313-316.

[36]Wu JF,Chen CH,Ni YH,etal.Toll-like receptor and hepatitis B virus clearance in chronic infected patients: a long-term prospective cohort study in Taiwan[J].J Infect Dis,2012,206(5):662-668.

[37]Zhou L,Wei B,Xing C,etal.Polymorphism in 3′-untranslated region of toll-like receptor 4 gene is associated with protection from hepatitis B virus recurrence after liver transplantation[J].Transpl Infect Dis,2011,13(3):250-258.

[38]資捷，王前，鄭磊，等.Toll樣受體4介導抑制Bewo細胞中乙型肝炎病毒的復制[J].中國熱帶醫(yī)學,2011,11(12):1445-1447.

[39]李常虹，陳悅，黃星，等.LPSp對HBV宮內感染臍血單個核細胞分泌IL-4、IFN-γ及TLR4表達的影響[J].中國婦幼保健,2012,27(12):1856-1858.

[40]Chou HH,Chien WH,Wu LL,etal.Age-related immune clearance of hepatitis B virus infection requires the establishment of gut microbiota[J].Proc Natl Acad Sci USA,2015,112(7):2175-2180.

[收稿2015-05-20修回2015-10-08]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.039

作者簡介：燕飛(1985年-)，女，碩士，住院醫(yī)師，主要從事慢性乙型肝炎發(fā)病機制方面的研究，E-mail:yanfeizhanche@sina.com。通訊作者及指導教師：朱堅勝(1965年-)，男，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士生導師，主要從事慢性乙型肝炎發(fā)病機制方面的研究，E-mail:zhujs@enzemed.com。

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0766-04

①本文受浙江省衛(wèi)生廳基金資助(2010KYB125)。