煙草煙霧通過TGF-β1/Smad2通路誘導(dǎo)RLE-6TN發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化①

巫鳳蘋　陳　虹　余秀英　廖　科　張　慧　張　露　陳亞娟

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，重慶400016)

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·基礎(chǔ)免疫學(xué)·

煙草煙霧通過TGF-β1/Smad2通路誘導(dǎo)RLE-6TN發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化①

巫鳳蘋陳虹余秀英廖科張慧張露陳亞娟

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，重慶400016)

[摘要]目的：探討煙草煙霧提取物(Cigarette smoke extract，CSE)在誘導(dǎo)大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞RLE-6TN發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)中的作用及機(jī)制。方法：以不同濃度(0.25%，0.5%及1%)CSE刺激RLE-6TN細(xì)胞株；TGF-β1受體抑制子(SB431542)預(yù)處理后，加入1% CSE共培養(yǎng)。實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測E-cadherin和Vimentin RNA表達(dá)；印跡法(Western blot)檢測TGF-β1、Smad2、磷酸化的Smad2(p-Smad2)、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：經(jīng)不同濃度的CSE作用，E-cadherin無論是在RNA還是在蛋白水平表達(dá)均下調(diào)，而Vimentin表達(dá)均上調(diào)；同時(shí)，TGF-β1、 p-Smad2和N-cadherin蛋白表達(dá)量增加；TGF-β1受體抑制子(SB431542)干預(yù)后， p-Smad2表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達(dá)量較對照組明顯增加(P<0.05)，N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)量較對照組明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：CSE可能通過激活TGF-β1/Smad2信號通路,參與調(diào)節(jié)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)RLE-6TN發(fā)生EMT。

[關(guān)鍵詞]大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞；煙草煙霧提取物；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；TGF-β1；p-Smad2

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指完全分化的上皮細(xì)胞發(fā)生表型改變后轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞。EMT參與機(jī)體多個(gè)生理病理過程，在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用。最近的研究表明EMT在呼吸系統(tǒng)疾病，如慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[1,2]。吸煙是COPD的重要高危因素，目前已知的煙草煙霧成分復(fù)雜，因其患病率和死亡率高,造成沉重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。文獻(xiàn)報(bào)道煙草煙霧可誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3-5]，提示EMT可能參與吸煙所致肺損傷，但具體發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。

TGF-β1是一種多功能蛋白質(zhì)，是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的重要因子之一，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，從上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的細(xì)胞，同時(shí)伴隨上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-cadherin的喪失，從而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物如Vimentin、Fibronectin和 N-cadherin[6，7]。TGF-β1與配體結(jié)合后，可激活受體性Smad2和Smad3，進(jìn)而與共同通路性Smad4形成三聚體轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)[8]。而煙草燃燒所產(chǎn)生的煙霧中含大量的自由基(Reactive oxygen species ,ROS)，如烷基、烷氧基、Nox自由基等[9]，可以促進(jìn)TGF-β1釋放，引起下游Smad2/3 瀑布式激活，進(jìn)而促進(jìn)支氣管重塑[10]。我們前期研究亦發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad2信號通路參與CSE誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡[11]。故我們認(rèn)為煙草煙霧可能通過TGF-β1/Smad2信號通路調(diào)節(jié)RLE-6TN發(fā)生EMT，進(jìn)而導(dǎo)致肺部疾病。

本研究首次在RLE-6TN中探究CSE通過TGF-β1/Smad2信號通路調(diào)節(jié)肺泡細(xì)胞發(fā)生EMT。我們選取E-cadherin作為上皮表型標(biāo)志物，N-cadherin和Vimentin作為間質(zhì)表型標(biāo)志物[3,12-14]，通過CSE誘導(dǎo)RLE-6TN，檢測上述EMT特征蛋白表達(dá)，進(jìn)一步探討煙草煙霧所致肺損傷的發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物、試劑和儀器高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司；SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；E-cadherin、N-cadherin抗體購自Abcam公司；Vimentin抗體、Smad2以及p-Smad2均購自美國Cell Signaling Technology公司；TGF-β1多克隆抗體購自美國ImmunoWay公司；GAPDH抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購于美國Santa公司；SB431542 購于美國MCE公司；ECL發(fā)光液購自美國Milipore公司；RNAiso Plus試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix均購自TaKaRa公司；其余均為國產(chǎn)試劑；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；超低溫冰箱，美國Revco公司；高速臺式離心機(jī)，美國Sigma公司；純水儀，美國Milipore公司；M450酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad公司； PAC3000型電泳儀、電轉(zhuǎn)儀，北京六一公司。

1.1.2細(xì)胞株來源及培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(RLE-6TN)購自上海必暢生物科技有限公司(細(xì)胞來自美國模式培養(yǎng)物集存庫，貨號：CRL-2300，國內(nèi)傳代)。用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2及飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對數(shù)生長期進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1CSE的制備宏升牌香煙購自重慶煙草公司，每只煙成分：焦油11 mg，一氧化碳17 mg，尼古丁1.1 mg。根據(jù)Wirtz[15]文獻(xiàn)中提及的CSE制備方法進(jìn)行操作。簡要描述如下：去掉過濾嘴，安放在抽吸裝置上，點(diǎn)燃香煙。勻速地抽吸，使煙霧通過一個(gè)裝有10 ml無血清的DMEM培養(yǎng)基的玻璃瓶，此時(shí)可見煙草煙霧勻速通過DMEM培養(yǎng)基并產(chǎn)生大小均勻的氣泡，且保證每支香煙燃燒4 min。當(dāng)10支香煙燃燒產(chǎn)生的煙霧通過該培養(yǎng)基后，停止抽吸。調(diào)節(jié)煙草煙霧-DMEM培養(yǎng)基混合物的pH至7.4，并用0.22 μm的過濾器除去雜質(zhì)和細(xì)菌，即為CSE。使用Beckman DU 640 分光計(jì)(Fullerton,CA,USA)測定CSE在320nm處的吸光度值，約為1.36±0.12，將此時(shí)對應(yīng)的CSE設(shè)為100%。實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將100%CSE稀釋至所需濃度即可。CSE現(xiàn)配現(xiàn)用，在制備好30 min內(nèi)使用。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測E-cadherin、Vimentin RNA的表達(dá)取處于對數(shù)生長期的RLE-6TN細(xì)胞以2×105ml-1的密度接種于六孔板中，分別設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為0.25%、0.5%、1%CSE處理48 h后收集細(xì)胞，采用Trizol法分別提取各細(xì)胞內(nèi)的總RNA，經(jīng)核酸濃度測定儀(Fullerton,CA,USA)測定RNA的濃度，并且樣品A260/280比值均介于1.8～2.0。使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用兩步法將樣品逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后在PCR儀(Bio-Rad,USA)上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR測定上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的RNA表達(dá)量。用于擴(kuò)E-cadherin目的片段的上游引物為：5′-TCATCACAGACCCCAAGACC-3′,下游引物為：5′-GATCTCCAGACCCACACCAA-3′；Vimentin上游引物為：5′-TGACATTGAGATCGCCACCT-3′,下游引物為：5′-TCATCGTGGTGCTGAGAAGT-3′。

1.2.3Western blot檢測TGF-β1、Smad2、p-Smad2和EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)取處于對數(shù)生長期的RLE-6TN以5×105ml-1的密度接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為0.25%、0.5%、1%CSE處理72 h，用細(xì)胞裂解液于冰上裂解各組細(xì)胞30 min，12 000 r/min 離心10 min，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。每個(gè)點(diǎn)樣孔加樣40 μg蛋白樣品液，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到0.45 μm的PVDF膜，5%的脫脂牛奶或BSA封閉膜上的蛋白結(jié)合位點(diǎn)2 h。采用TGF-β1(1∶500)、Smad2(1∶1 000)、p-Smad2(1∶1 000)、E-cadherin(1∶3 000)、N-cadherin(1∶8 000)、Vimentin(1∶1 000)、內(nèi)參GAPDH多抗(1∶1 000),4℃孵育過夜。用TBST溶液漂洗3次，每次10 min。分別加入辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)常溫孵育2 h。TBST溶液漂洗,用ECL試劑發(fā)光。運(yùn)用圖像分析軟件Quantity One分析條帶的灰度值，將對照組和實(shí)驗(yàn)組目的條帶的灰度值和內(nèi)參的灰度值比值表示蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平。

1.2.4TGF-β1受體抑制子SB431542阻滯TGF-β1/Smad2信號通路取處于對數(shù)生長期的RLE-6TN以5×105ml-1的密度接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，分別設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組，常規(guī)培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為10、100、10 00 nmol/L的SB431542處理48 h，提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量。并用Western blot檢測Smad2和p-Smad2的表達(dá)量，以篩選TGF-β1受體抑制子的最佳實(shí)驗(yàn)濃度。再取對數(shù)生長期的RLE-6TN設(shè)置空白對照組、CSE處理組、SB431542處理組、CSE+ SB431542處理組，常規(guī)培養(yǎng)72 h，提取各組細(xì)胞總蛋白，后用Western blot檢測Smad2、p-Smad2、EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)量。

2結(jié)果

2.1CSE對RLE-6TN細(xì)胞E-cadherin、Vimentin RNA的影響不同濃度的CSE作用RLE-6TN細(xì)胞48 h后，提取總RNA檢測E-cadherin(圖1A)和Vimentin(圖1B)表達(dá)量。處理組隨著CSE濃度的上升E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，在CSE濃度為1%，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CSE濃度為1%時(shí)Vimentin的表達(dá)上調(diào)，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他CSE組Vimentin表達(dá)量與對照組比較，無明顯變化(P>0.05)。

2.2CSE對RLE-6TN細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響運(yùn)用Western blot方法檢測CSE對RLE-6TN細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的影響。如圖2所示， CSE處理后E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，在濃度為0.25%、0.5%和1%時(shí)與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。N-cadherin在濃度為0.5%和1%時(shí)蛋白表達(dá)上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CSE處理后Vimentin的蛋白表達(dá)上調(diào)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，CSE能調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的變化，誘導(dǎo)EMT發(fā)生，在濃度為1%最明顯，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)CSE選用1%作為工作濃度(圖1、2)。

2.3Western blot檢測TGF-β1、Smad2和p-Smad2蛋白的表達(dá)運(yùn)用Western blot方法檢測CSE對RLE-6TN細(xì)胞TGF-β1/Smad2信號通路蛋白的影響。結(jié)果顯示隨著CSE的增加，TGF-β1蛋白的表達(dá)上調(diào)，與對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CSE處理后， p-Smad2蛋白表達(dá)增加，在CSE濃度為0.5%和1%時(shí)與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，CSE能激活RLE-6TN中的TGF-β1/Smad2信號通路，并能誘導(dǎo)EMT發(fā)生(圖2和圖3)。但兩者之間是否有內(nèi)在聯(lián)系，尚需進(jìn)一步論證。

圖1　CSE對RLE-6TN細(xì)胞E-cadherin和Vimentin mRNA的影響Fig.1　mRNA expressions of E-cadherin and Vimentin in different groups were detected by real-time PCRNote: Treated RLE-6TN with CSE at different concentrations for 48 h,then total RNA was isolated for real-time PCR to detect the mRNA expressions of E-cadherin(A)and Vimentin(B).Values are mean±SD of three independent experiments.*.P<0.05,**.P<0.01 compared with control.

圖2　CSE對RLE-6TN細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響Fig.2　Effects of CSE on expressions of EMT markers in RLE-6TNNote: Treated RLE-6TN with different concentrations of CSE,the expressions of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and GAPDH in cell lysis were detected by Western blot.The figures were visualized and quantified using quantity one software.Values are mean±SD of three independent experiments.*.P<0.05,**.P<0.001 compared with control.

圖3　煙草煙霧提取物對RLE-6TN細(xì)胞TGF-β1、Smad2和p-Smad2蛋白的影響Fig.3　Effects of CSE on expressions of TGF-β1,Smad2 and p-Smad2 proteins in RLE-6TNNote: 0.25%-1% of CSE co-cultured with RLE-6TN ,the expressions of TGF-β1,Smad2,p-Smad2 and GAPDH were detected by Western blot.The figures were visualized and quantified using quantity one software.Values are mean±SD of three independent experiments.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 compared with control.

圖4　SB431542對RLE-6TN細(xì)胞中Smad2磷酸化的影響Fig.4　Effects of SB431542 on expressions of Smad2 and p-Smad2 proteins in RLE-6TNNote: 10-1 000 nmol/L of SB431542 were co-cultured with RLE-6TN cells for 48 h.Expressions of p-Smad2 and Smad were detected by Western blot.The figures were visualized and quantified using quantity one software.Values are mean±SD of three independent experiments.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001 compared with control.

2.4阻滯TGF-β1/Samd2信號通路,篩選SB431542的最佳濃度Smad2是TGF-β1信號下傳的第一個(gè)分子。當(dāng)Smad2接受經(jīng)TGF-β1傳遞的信號后，會發(fā)生磷酸化，故通過檢測RLE-6TN細(xì)胞Smad2磷酸化的情況，可以間接地反映TGF-β1/Samd2信號通路被激活的情況。將不同摩爾濃度(10、100、1 000 nmol/L)的TGF-β1受體抑制子(SB431542)與RLE-6TN共培養(yǎng)，提取總蛋白，檢測TGF-β1信號通路的下游蛋白Smad2的磷酸化情況，以評估TGF-β1受體抑制子對TGF-β1/Smad2通路的阻滯效率，用以篩選SB431542的最佳濃度。如圖4示SB431542在10～1 000 nmol/L范圍內(nèi)對RLE-6TN中TGF-β1/Smad2通路的阻滯作用逐漸增強(qiáng)，且1 000 nmol/L的SB431542對最大限度地阻止TGF-β1/Smad2通路。

圖5　阻滯TGF-β1/Smad2通路后，觀察CSE對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5　Block TGF-β1/Smad2 pathway and detect expressions of EMT markersNote: 1 000 nmol/L SB431542 was added into the CSE-treated rat lung epithelial cells to block the TGF-β1/Smad2 pathway.The expressions of p-Smad2 and EMT markers were detected by Western blot.Values were mean±SD of three independent experiments.*.P<0.05,**.P<0.001，significant difference from the control group;#.P<0.05,##.P<0.01，significant difference from the CSE induced groups.

2.5阻滯TGF-β1/Smad2信號通路對CSE誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的影響為進(jìn)一步研究TGF-β1/Smad2信號通路在CSE誘導(dǎo)的RLE-6TN中的作用，我們將TGF-β1/Smad2通路阻滯后，觀察CSE對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示(圖5)，SB431542與CSE共培養(yǎng)后，與CSE組比較，E-cadherin表達(dá)增加；N-cadherin和Vimentin表達(dá)下降，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明SB431542能部分逆轉(zhuǎn)CSE誘導(dǎo)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。由此說明，CSE通過激活TGF-β1/Smad2信號通路誘導(dǎo)RLE-6TN發(fā)生EMT。

3討論

COPD是一種以氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，氣流受限不可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，甚至危及生命。吸煙是COPD發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素[16]。吸煙引起呼吸道慢性炎癥和肺氣腫的發(fā)生發(fā)展，導(dǎo)致氣道的不可逆受阻和肺功能的急劇下降[17]。已有研究證明，煙草煙霧可誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H358 、支氣管上皮細(xì)胞和A549發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[3-5]。有研究證實(shí)，煙草煙霧可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，COPD患者的肺組織中亦可見上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[2,4]，故EMT可能參與吸煙所致肺損傷及肺部疾病如COPD，但其致病機(jī)制復(fù)雜，目前仍不十分明確。

本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR技術(shù)，結(jié)果顯示CSE可誘導(dǎo)E-cadherin RNA表達(dá)下調(diào)， Vimentin RNA表達(dá)上調(diào)(圖1),表明CSE可誘導(dǎo)RLE-6TN細(xì)胞發(fā)生EMT。經(jīng)CSE處理細(xì)胞后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)RLE-6TN細(xì)胞發(fā)生EMT改變(圖2)：E-cadherin蛋白隨CSE濃度增加而下調(diào)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)則上調(diào)。并且CSE能激活TGF-β1/Smad2信號通路(圖3)，這些都與Wang等[10]得出的結(jié)論一致。為進(jìn)一步論證，TGF-β1/Smad2信號通路在CSE誘導(dǎo)的RLE-6TN細(xì)胞發(fā)生EMT中的作用，我們通過抑制劑SB431542阻滯掉TGF-β1/Smad2通路，發(fā)現(xiàn)該通路被阻滯后，能逆轉(zhuǎn)CSE對EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)(圖5)。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族中的一員。其對炎癥、組織修復(fù)和胚胎發(fā)育以及細(xì)胞的生長和分化都有重要的調(diào)節(jié)作用。越來越多的實(shí)驗(yàn)證明不論在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還是體外實(shí)驗(yàn)TGF-β1都是EMT的重要調(diào)節(jié)因子。Smads家族蛋白是TGF-β1信號由細(xì)胞外傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中關(guān)鍵載體，在TGF-β1家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起傳遞信號的作用。TGF-β1與其配體形成的復(fù)合物，可激活Smads進(jìn)入核內(nèi)，共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄。我們前期研究發(fā)現(xiàn)CSE可刺激肺泡上皮細(xì)胞分泌TGF-β1增加[11]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，CSE可誘導(dǎo)大鼠肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，激活TGF-β1/Smad2信號通路，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)N-cadherin和Vimentin；阻滯TGF-β1/Smad2信號通路后，能逆轉(zhuǎn)CSE對EMT相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。

綜上所述，煙草煙霧中的有害物質(zhì)，可以誘導(dǎo)RLE-6TN發(fā)生EMT，其機(jī)制可能為煙草煙霧激活肺泡上皮細(xì)胞中的TGF-β1/Smad2信號通路。通過研究TGF-β1/Smad2信號通路在CSE誘導(dǎo)的RLE-6TN發(fā)生EMT中的作用，可以為研究煙草煙霧所致的肺部疾病提供思路和參考，為治療此類疾病提供新的靶點(diǎn)。

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[收稿2015-08-30修回2015-10-14]

(編輯張曉舟)

Cigarette smoke extract induce EMT of RLE-6TN cells via TGF-β1/Smad2 pathway

WUFeng-Ping,CHENHong,YUXiu-Ying,LIAOKe,ZHANGHui,ZHANGLu,CHENYa-Juan.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect of cigarette smoke extract(CSE)induced EMT in rat alveolar type Ⅱ cells(RLE-6TN).Methods: The different concentrations of CSE co-cultured with RLE-6TN and inhibitor of the transforming growth factor-β1(TGF-β1)typeⅠ receptor was administered prior to CSE exposure (SB431542).Expression levels of E-cadherin and Vimentin were examined by RT-PCR.The expression levels of TGF-β1,p-Smad2,Smad2,E-cadherin,N-cadherin and Vimentin were examined by Western blot.Results: Our results showed that the expression of E-cadherin decreased in CSE-treated group,while the expression of TGF-β1,p-Smad2,N-cadherin and Vimentin obviously increased after CSE exposure,however,which could be abrogated by SB431542.Conclusion: TGF-β1/Smad2 signal pathway may be involved in the CSE induced EMT in rat alveolar cells.

[Key words]Rat alveolar type Ⅱ cells;Cigarette smoke extract;Epithelial-mesenchymal transition;TGF-β1；p-Smad2

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.002

作者簡介：巫鳳蘋(1989年-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制研究。通訊作者及指導(dǎo)教師：陳亞娟(1980年-)，女，博士，講師，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)小氣道疾病發(fā)病機(jī)制的研究，E-mail：yajuanchencqmu@sina.com。

中圖分類號R363.2+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0615-05

①本文受國家自然科學(xué)基金青年基金(81200009)、重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥研究課題(ZY20132165)和國家臨床重點(diǎn)?？茖ｍ?xiàng)資助(衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號)。