Rheb突變體重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定*

趙 莉 鄒鎮(zhèn)洪 葉永斌 侯敬申

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院蛇毒研究所,廣東 廣州 510182； 2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室,廣東 廣州 510515；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急診外科,廣東 廣州 510260)

Rheb(Ras homolog enriched in brain)是一種Ras蛋白，在結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis complex, TSC)相關(guān)蛋白TSCl/TSC2和多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)之間傳遞信號(hào)。Rheb通過與mTOR的內(nèi)源性抑制分子FKBP38結(jié)合活化mTOR通路[1]，進(jìn)而使其下游靶標(biāo)S6K1(40S ribosomal S6 kinase 1)和4E-BP1(eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1)的磷酸化，從而調(diào)控蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞生長、增殖、遷移和分化[2]。

腫瘤細(xì)胞的一個(gè)顯著特征是增殖能力明顯增強(qiáng)，通過抑制Rheb活性進(jìn)而使阻斷mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有可能使細(xì)胞增殖減慢，起到延緩癌癥進(jìn)展的目的[3]。本研究采用復(fù)制缺陷型腺病毒作為基因表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶Rheb顯性失活型突變體的重組腺病毒載體，通過轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，驗(yàn)證Rheb及其下游蛋白的表達(dá)；將包裝病毒顆粒感染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，觀察其在無血清時(shí)的增殖情況，為體內(nèi)外研究Rheb基因?qū)TOR通路的作用及乳腺癌的基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒與菌株 大腸桿菌E.coli TOP10菌株及攜帶野生型Rheb或Rheb突變基因的原始質(zhì)粒pCDNA3.1-flag-Rheb-WT、pCDNA3.1-flag-Rheb-D60K和 pCDNA3.1-flag-Rheb-Q64L(南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室保存)；穿梭質(zhì)粒pacAd5 CMVK-NpA、pacAd5 CMV-GFP Control Vector、腺病毒骨架載體pacAd5 9.2-100(New England Biolabs)；病毒包裝細(xì)胞HEK-293 AD-100細(xì)胞(Cell BioLabs)；人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及MDA-MB-231(上海細(xì)胞庫)。

1.2酶及其他生化試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和PacⅠ(New England Biolabs)；T4 DNA ligase、DNA純化回收試劑盒(TaKaRa)；1 kb plus DNA Ladder(天根生化科技(北京)有限公司)；質(zhì)粒DNA小/中提試劑盒(深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司)；脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000(Invitrogen)；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)；胎牛血清(GIBCO)；腺病毒純化試劑盒(Cell BioLabs)；Rheb單克隆抗體(MILLIPORE Cat.#09-247)；β-actin多克隆抗體(SIGMA Cat.#A2668)；S6多克隆抗體(SANTA CRUE BIOTECHNOLOGY Cat.#SC-74459)；P-S6多克隆抗體(CELL SIGNALING TECHNOLOGY Cat.#2211)；辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)-兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。PCR引物合成及基因片段測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。四甲基偶氮唑鹽(MTT)為Amresco進(jìn)口分裝。

1.3重組質(zhì)粒pacAd5 CMV-Rheb的構(gòu)建與鑒定 取pacAd5 CMVK-NpA和pCDNA3.1-flag-Rheb-WT質(zhì)粒，分別經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，將目標(biāo)片段電泳回收、純化；將pacAd5 CMVK和Rheb-WT片段用T4 DNA ligase 16 ℃定向連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑選菌落，擴(kuò)增、小量提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ/XhoⅠ 雙酶切篩選含Rheb基因片斷的重組質(zhì)粒pacAd5 CMV-Rheb-WT，將酶切初步鑒定陽性的質(zhì)粒送測(cè)序。同樣的方法獲得pacAd5 CMV-Rheb-D60K和pacAd5 CMV-Rheb-Q64L。

1.4pacAd5-GFP和pacAd5-Rheb重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增與純化 轉(zhuǎn)染前1 d，將HEK-293 AD-100細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)至70%～80%融合。分別取pacAd5 CMV-GFP和pacAd5 9.2-100質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切線性化，LipofectamineTM 2000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)完全細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)，收集細(xì)胞，于-80 ℃與37 ℃反復(fù)凍融3次，由此獲得第一代pacAd5-GFP腺病毒。將第一代腺病毒感染HEK-293 AD-100細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)擴(kuò)增，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｍ瑯拥姆椒ǐ@得pacAd5-Rheb-WT、pacAd5-Rheb-D60K和pacAd5-Rheb-Q64L重組腺病毒。

1.5pacAd5-GFP和pacAd5-Rheb重組腺病毒的PCR擴(kuò)增及鑒定 取純化的pacAd5-GFP對(duì)照病毒與pacAd5-Rheb病毒上清液各5 μl，分別與1 μl蛋白酶K(20 g·L-1)在55 ℃的溫水中水浴1 h，100 ℃煮沸5 min。離心后取1 μl上清稀釋液為模板，使用引物5′-CCGCTCGAGACCATGGACTACAAAGACCATCATGACG-3′(p1)和5′- AGCATTGAATTCTCACATCACCGAGCATGAAGA-3′(p2)。PCR擴(kuò)增Rheb基因。產(chǎn)物大小約為555 bp。

1.6pacAd5-Rheb在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)及免疫印跡鑒定 將MCF-7細(xì)胞以5×106/孔密度接種于6孔板中，待融合至80%～90%密度時(shí)， 加入病毒感染(包括對(duì)照病毒及磷酸鹽緩沖液)。 48 h后收集細(xì)胞，抽提總蛋白，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。

1.7重組腺病毒介導(dǎo)Rheb的過表達(dá)和功能抑制對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231無血清條件下增殖的影響 調(diào)整MDA-MB-231細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/ml，接種于96 孔板，每孔100 μl，每組設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，血清饑餓，分別加入pacAd5-Rheb-WT、pacAd5-Rheb-D60K、pacAd5-Rheb-Q64L和pacAd5-GFP重組腺病毒，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μl MTT(2 mg/ml)。37 ℃孵育4 h，棄去MTT溶液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，微孔板振蕩器上振蕩10 min，待結(jié)晶物完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在570 nm波長處的吸光度值A(chǔ)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒pacAd5 CMV-Rheb的構(gòu)建與鑒定 攜帶Rheb目的基因的pCDNA3.1-flag-Rheb經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后PCR擴(kuò)增可獲得大小為555 bp(Rheb)的單個(gè)片段(圖1) 。穿梭質(zhì)粒pacAd5 CMVK-NpA經(jīng) EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后可獲得大小約為6.2 kb的單個(gè)片段(圖2)。EcoRⅠ/XhoI 雙酶切篩選攜帶Rheb基因片斷的重組質(zhì)粒pacAd5 CMV-Rheb，可獲得大小分別為6.2 kb(pacAd5 CMV)和(500～700)bp(Rheb)之間的兩個(gè)片段(圖3)。將酶切后(500～700)bp(555bp)的基因片段經(jīng)測(cè)序，證明為正確的目的片段。

2.2pacAd5 9.2-100質(zhì)粒PacⅠ酶切線性化 取pacAd5 9.2-100質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切釋放出一段大于20 kb(33 kb)的大片段和約2 kb的特征性小片段(圖4)。

圖1 原始質(zhì)粒pCDNA3.1-flag-Rheb 經(jīng)PCR后雙酶切鑒定

M:DNA markers; 1:pCDNA3.1-flag-Rheb-WT; 2:pCDNA3.1-flag-Rheb-D60K;3:pCDNA3.1-flag-Rheb-Q64L

圖2 穿梭質(zhì)粒pacAd5 CMVK-NpA雙酶切鑒定

M:DNA markers;1:pacAd5 CMVK-NpA

圖3 重組質(zhì)粒pacAd5 CMV-Rheb的雙酶切鑒定

M:DNA markers;1:pacAd5 CMV-Rheb-WT;2:pacAd5 CMV-Rheb-D60K;3:pacAd5 CMV-Rheb-Q64L

圖4 腺病毒骨架載體pacAd5 9.2-100的PacⅠ單酶切鑒定

M:DNA markers;1:pacAd5 9.2-100 backbone vector

2.3pacAd5-GFP和pacAd5-Rheb重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增 轉(zhuǎn)染后2 d，普通光源與倒置熒光顯微鏡下顯示：感染了pacAd5-GFP病毒的HEK-293 AD-100細(xì)胞中有GFP表達(dá)，并隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，8 d后細(xì)胞呈現(xiàn)明顯細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)：細(xì)胞變圓，脫壁、變大，出現(xiàn)明顯噬斑。

2.4pacAd5-GFP和pacAd5-Rheb重組腺病毒PCR鑒定 取pacAd5-GFP對(duì)照病毒與pacAd5-Rheb病毒上清液各5 μl，分別與1 μl蛋白酶K(20 g/L)在55 ℃的溫水中水浴1 h，100 ℃煮沸5 min，高速離心后取1 μl上清稀釋液為模板，以特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得(500～700)bp(555bp)的特異性擴(kuò)增條帶(圖5)。

圖5 pacAd5-GFP和pacAd5-Rheb突變體重組腺病毒上清Rheb基因的PCR鑒定

M:DNA markers;1:pacAd5-Rheb-WT;2:pacAd5-Rheb-D60K;3:pacAd5-Rheb-Q64L

2.5重組腺病毒pacAd5-GFP和pacAd5-Rheb在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá) 取純化后的pacAd5-GFP對(duì)照病毒及pacAd5-Rheb重組病毒，感染MCF-7細(xì)胞，結(jié)果表明Rheb重組病毒與GFP對(duì)照病毒均能較好感染MCF-7細(xì)胞，24 h時(shí)細(xì)胞狀態(tài)均良好(圖6)。GFP對(duì)照病毒組感染后24 h，MCF-7細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多GFP表達(dá)，隨時(shí)間增強(qiáng)。Western blotting結(jié)果顯示，腺病毒感染的MCF-7細(xì)胞內(nèi)Rheb蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，S6及β-actin蛋白的表達(dá)各組間沒有顯著性差異，而WT和Q64L組MCF-7細(xì)胞的P-S6表達(dá)較陰性對(duì)照組和D60K組顯著增強(qiáng) (圖7)。

圖6 重組pacAd5-GFP腺病毒感染乳腺癌MCF-7細(xì)胞株

圖7 Western blot檢測(cè)Rheb在MCF-7細(xì)胞株的表達(dá)

1:negative control(PBS); 2:pacAd5-Rheb-WT;3:pacAd5-Rheb-D60K ; 4:pacAd5-Rheb-Q64L

2.6感染Rheb突變體的重組腺病毒對(duì)無血清培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖能力的影響 感染Q64L組的細(xì)胞在血清饑餓時(shí)增殖能力較對(duì)照組、WT和D60K組增強(qiáng)。而感染D60K組乳腺癌細(xì)胞增殖較其他組明顯減慢(圖8)。

圖8 感染Rheb突變體重組腺病毒對(duì)血清饑餓48h乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231增殖的影響

*vs EGFP，P﹤0.05。

3 討 論

mTOR是哺乳類動(dòng)物中的一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞生長過程中的中心調(diào)節(jié)因子，Rheb可以激活該通路[2]。對(duì)Rheb的結(jié)構(gòu)及突變分析表明，Rheb的switch I、switch II結(jié)構(gòu)域及一些氨基酸對(duì)其功能的發(fā)揮起重要作用，這些氨基酸位點(diǎn)的突變體可改變Rheb本身及對(duì)mTOR的活性，如Rheb Q64L、S16H起激活作用，而D60K、S20N、T38M、I39K、N41A為抑制其活性[4-5]。

由于腺病毒載體在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞上進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移和蛋白表達(dá)的高效性，使其在基因治療和臨床研究中應(yīng)用廣泛，是使用最多的病毒載體之一[6]。復(fù)制缺陷型腺病毒載體既可以感染分裂細(xì)胞又可以感染非分裂細(xì)胞；感染效率高，容易制備高滴度的病毒粒子；不裂解靶細(xì)胞，重組腺病毒導(dǎo)入細(xì)胞的目的基因并不整合入宿主細(xì)胞染色體中。其在腺病毒中插入報(bào)告基因GFP，使得病毒感染效率檢測(cè)簡(jiǎn)單方便[7]。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建攜帶Rheb及其顯性失活突變體的腺病毒表達(dá)載體，同時(shí)初步研究Rheb-D60K對(duì)乳腺癌細(xì)胞血清饑餓后增殖能力的影響。結(jié)果顯示：腺病毒pacAd5-Rheb-D60K感染的MCF-7 細(xì)胞能使Rheb下游的S6 和P-S6蛋白表達(dá)減少；pacAd5-Rheb-D60K感染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231后，在血清饑餓后細(xì)胞增殖明顯變慢，這將為后續(xù)更好地研究Rheb基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞生長、增殖、凋亡、分化調(diào)控及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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