小RNA病毒3A基因及其編碼蛋白研究進(jìn)展

張盛勇，程安春，汪銘書

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小RNA病毒3A基因及其編碼蛋白研究進(jìn)展

張盛勇，程安春，汪銘書

1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130

摘要：小RNA病毒3A蛋白是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，本文主要介紹3A基因以及其編碼蛋白的特點(diǎn)，3A蛋白對(duì)細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用以及與其他蛋白的相互作用，3A蛋白與ARF家族在囊泡運(yùn)輸中作用的機(jī)制等。

關(guān)鍵詞：小RNA病毒；3A基因；3A蛋白

小RNA病毒科家族龐大，由29個(gè)屬50個(gè)種組成(http://www.ictvonline.org/)。根據(jù)小RNA病毒翻譯起始所必需的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site, IRES)元件的二級(jí)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特征可以將其劃分為5個(gè)不同的型。Ⅰ型主要包括腸道病毒屬(Enterovirus),以脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV)為典型；Ⅱ型包括口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)和心病毒屬(Cardiovirus)等,以口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)和腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)為典型；Ⅲ型以肝病毒屬(Hepatovirus)的甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV )為代表；Ⅳ型包括禽肝病毒屬(Avihepatovirus)等，以鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus ,DHV)為代表；近年被發(fā)現(xiàn)的4型主要包括嵴病毒屬(Kobuvirus)等中的成員[1-2]。小RNA病毒顆粒無(wú)囊膜，直徑約為30 nm，呈20面體對(duì)稱，外表光滑呈球形。病毒基因組沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)，其RNA編碼一個(gè)多聚前蛋白，其后再由病毒自身所編碼的蛋白酶加工，使之成為成熟的蛋白。起初的切割將多聚蛋白分為3個(gè)區(qū)域，P1區(qū)、P2區(qū)和P3區(qū)。其中位于P1區(qū)的蛋白VP0(VP2和VP4)、VP1和VP3為結(jié)構(gòu)蛋白，P2區(qū)裂解為2A、2B、2C蛋白，P3區(qū)裂解為3A、3B、3C和3D蛋白，P2和P3都為非結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒的各項(xiàng)生命活動(dòng)。其中3A蛋白是膜結(jié)合蛋白，主要起到錨定復(fù)制復(fù)合體、抑制宿主蛋白的分泌以及調(diào)節(jié)膜蛋白遞呈等作用，在病毒的復(fù)制中起到了相當(dāng)重要的作用。本文就3A基因及其編碼蛋白的特點(diǎn)和相關(guān)功能進(jìn)行綜述，以便對(duì)小RNA病毒病原的進(jìn)一步研究工作打下基礎(chǔ)。

13A基因序列及其編碼蛋白特征

1.13A基因序列特征小RNA病毒基因組由單一正鏈RNA組成,大小約7.0 kb～8.5 kb。其中包括5′端非編碼區(qū)(Untranslate Region，5′UTR)和3′端非編碼區(qū)(3′UTR),基因組5′UTR長(zhǎng)600 nt～1 300 nt，連接有一個(gè)病毒小蛋白VPg，3′UTR長(zhǎng)約為45 nt～345 nt，基因3′端非編碼區(qū)具有poly A尾結(jié)構(gòu)，在這兩者之間是病毒的僅有的開放閱讀框(Open Read Frame,ORF)。當(dāng)病毒ORF在宿主細(xì)胞中表達(dá)出其多聚前蛋白后，被病毒自身所編碼的蛋白酶切割成為成熟的蛋白。在多聚蛋白近N段1/3處編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白(P1)，組裝成病毒的衣殼。剩下2/3的部分則編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白(P2,P3)，主要參與對(duì)病毒復(fù)制所需的相關(guān)蛋白、宿主防御系統(tǒng)和宿主核糖體復(fù)合體等結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，使病毒核酸在宿主細(xì)胞內(nèi)得到完整的復(fù)制和翻譯。3A基因位于P3區(qū)，由于病毒的不同其基因序列上也存在一定的差異，如PV 3A基因含有261核苷酸，能夠編碼87氨基酸；鴨肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus ,DHV)含有279核苷酸，編碼93氨基酸；口蹄疫病毒3A蛋白的C末端比其他的小RNA病毒都要長(zhǎng)，總共含有459核苷酸，可以編碼153氨基酸的蛋白[3-5]。同樣是在口蹄疫病毒中，在97年臺(tái)灣的分離株上也發(fā)現(xiàn)C端附近有10個(gè)氨基酸缺失的毒株，并且之后的對(duì)其C端附近的氨基酸缺失的重組病毒的體外實(shí)驗(yàn)中，都能連續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)10代以上[6-8]。說(shuō)明了小RNA病毒的3A基因序列在大小上是較為保守的，部分的差異體現(xiàn)在C端的長(zhǎng)度差異，但這些差異對(duì)病毒的影響并不大。

1.23A基因編碼蛋白的特征小RNA病毒3A蛋白是其前體3AB蛋白的切割產(chǎn)物，3A和3B通常是以二聚體的狀態(tài)存在[9]。在3A蛋白C端都具有一段很強(qiáng)的疏水區(qū)，并且這個(gè)疏水區(qū)域是相當(dāng)保守的。張廣宇等人在對(duì)FMDV毒株的研究發(fā)現(xiàn)，有6個(gè)α螺旋在蛋白前段形成了親水性強(qiáng)的內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)，而蛋白的后段則主要是由無(wú)規(guī)卷曲形成的疏水區(qū)[10]。González-Magaldi等人的研究也表明了，3A編碼區(qū)的前半部分也是比較保守的親水區(qū)域[11]。在PV的研究中進(jìn)一步確定到了，3A蛋白在其C端有22個(gè)殘基組成的疏水結(jié)構(gòu)域[3, 12]。3A蛋白的這種同時(shí)具有部分強(qiáng)疏水區(qū)和部分親水區(qū)的結(jié)構(gòu)，使得其蛋白具有跨膜的功能，對(duì)其在病毒生命過(guò)程中的定位起到了決定性作用。

23A蛋白的功能

2.1蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制功能部分小RNA病毒的3A蛋白具有抑制蛋白質(zhì)在高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)功能,其中包括干擾素IFN-β、白細(xì)胞介素IL-6、白細(xì)胞介素IL-8、主要組織相容性復(fù)合體MHC-Ⅰ、腫瘤壞死因子TNF受體等宿主防御相關(guān)的分子[13-15]。例如在腸道病毒的免疫逃逸機(jī)制中，3A蛋白對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的抑制起著重要作用[16-17]。同樣在對(duì)柯薩奇病毒 B3(Coxsachievirus B3，CVB3) 3A蛋白的研究中也發(fā)現(xiàn)了其抑制蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的運(yùn)輸[17-18]。

該機(jī)制下蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制的根本原因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的雙向運(yùn)輸被阻斷，而此雙向運(yùn)輸功能是取決于外被蛋白Ⅰ(Coat Protein Ⅰ, COP Ⅰ)和外被蛋白II(coat protein II, COP II)的外包復(fù)合物的成功形成。COPⅠ募集到膜上是被GTP酶(Protein-synthesizing GTPases)作用的ADP核糖基化因子1(ADP-Ribosylation Factor 1，ARF1)嚴(yán)格控制的[12,19]。因此ARF-GDP 和ARF-GTP的正確調(diào)控是COP Ⅰ被募集到膜上的根本保證，也是雙向運(yùn)輸?shù)幕A(chǔ)。3A蛋白在細(xì)胞膜上能夠通過(guò)與高爾基體特異的BFA抗性因1 (Golgi-specific brefeldin A resistance factor 1，GBF1)的結(jié)合來(lái)阻斷ARF1的活化。結(jié)果導(dǎo)致COPⅠ不能被募集到膜上使得蛋白質(zhì)運(yùn)輸被抑制[20]。ElsWessels發(fā)現(xiàn)只有腸道病毒的3A蛋白能夠抑制COPⅠ募集到膜上，而在人鼻病毒、腦心肌炎病毒、口蹄疫病和甲型肝炎病毒的3A蛋白都不能抑制蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。與腸道病毒最為相似的輪狀病毒，本身不具備蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制功能，但當(dāng)其N端被CVB3 3A蛋白N端所取代后，使得重組病毒獲得了對(duì)GBF1的結(jié)合能力，能阻斷ARF1的活化，從而使得其具有蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制能力。然而在之后的研究中又發(fā)現(xiàn)71型腸道病毒的3A蛋白無(wú)法抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。該71型腸道病毒3A蛋白的第7位氨基酸有個(gè)非極性的脯氨酸，然而其他的腸病毒的第7位都是帶負(fù)電的氨基酸。由此認(rèn)為71型腸道病毒3A蛋白不具備抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能的主要原因有可能是該位點(diǎn)上氨基酸的改變所引起的，而其他的小RNA病毒在此位點(diǎn)上的氨基酸變化也有可能就是該抑制蛋白運(yùn)輸功能喪失的原因，而對(duì)于該位點(diǎn)的確認(rèn)還需要進(jìn)一步的研究。

2.2作為3D聚合酶的錨定功能研究表明3A蛋白在膜相關(guān)復(fù)合體的表面與GBF1/ARF1和ACBD3結(jié)合并形成復(fù)合體后,吸引細(xì)胞中的磷脂酰肌醇4-激酶IIIβ(Phosphatidylinositol 4-Kinase Class III Beta，PI4KIIIβ)募集到這個(gè)復(fù)合體上,催化膜磷脂分子轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇四磷酸(PI4P)[18,21-22]。隨后使得3D也被募集到被催化的膜上結(jié)合,并使得3D聚合酶活性的表現(xiàn)，進(jìn)而開始病毒RNA的復(fù)制過(guò)程[23-25]。Jeffrey J. DeStefano等人的研究表明，3AB能夠促進(jìn)3D聚合酶的合成，并且不會(huì)改變3D聚合酶的保真性[26]。在對(duì)PV的研究中發(fā)現(xiàn)，3AB蛋白可以直接結(jié)合到3CD前體蛋白上，然后能夠激活3CD蛋白的蛋白酶活性。所以認(rèn)為3AB蛋白能在RNA復(fù)制復(fù)合物中作為3D 聚合酶的錨定[27]。而3AB蛋白與膜結(jié)合部位主要為3A的強(qiáng)疏水區(qū)，因此認(rèn)為3A蛋白在RNA復(fù)制復(fù)合體的形成過(guò)程中，能將3D錨定到復(fù)制復(fù)合體上，并激活其聚合酶活性。

2.33A蛋白對(duì)病毒復(fù)制的影響非結(jié)構(gòu)蛋白的功能往往與病毒整個(gè)生命周期都有著重要的關(guān)聯(lián)。作為小RNA病毒非結(jié)構(gòu)蛋白之一的3A蛋白，其在病毒復(fù)制中起著非常重要的作用。有大量研究表明3A蛋白幾個(gè)堿基的突變會(huì)導(dǎo)致病毒RNA復(fù)制的受阻，可見3A蛋白是病毒RNA復(fù)制的關(guān)鍵。其強(qiáng)疏水區(qū)使得其可直接作用于膜系統(tǒng)，成功的與膜結(jié)合是病毒RNA復(fù)制復(fù)合體形成的基礎(chǔ)[28]。這使得其在病毒RNA復(fù)制的準(zhǔn)備階段中發(fā)揮著重要作用。在PV 3A蛋白和3CD蛋白中，George A等人使用海拉細(xì)胞提取的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)3A蛋白能與GBF1/ARF蛋白作用募集PI4Kβ到膜上形成復(fù)制復(fù)合體的功能[29]。大量的實(shí)驗(yàn)也表明3A蛋白還能與高爾基蛋白ACBD3相互作用來(lái)募集PI4Kβ到復(fù)制位點(diǎn)，該兩種不同的途徑是相互獨(dú)立的[21,30-32]。無(wú)論是通過(guò)何種途徑3A蛋白在小RNA病毒復(fù)制過(guò)程中都起到了相當(dāng)關(guān)鍵的作用。

33A蛋白與其他蛋白的作用

3.13A與3B的共同作用小RNA病毒3A蛋白能將復(fù)制復(fù)合體錨定到其改造好的膜上，功能活性與3B蛋白有著密切的聯(lián)系。3A蛋白和3B蛋白的前體3AB蛋白是一個(gè)多功能蛋白。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)3AB蛋白能以輔助因子的身份來(lái)激活3D聚合酶[28]。大量研究表明3AB蛋白具還有雙螺旋去穩(wěn)定功能。3AB的螺旋去穩(wěn)定性是沒(méi)有特異性的，可以作用于DNA雙鏈、RNA雙鏈以及RNA和DNA的雜交雙鏈，并且該活性不存在方向性。能使RNA鏈不穩(wěn)定，促進(jìn)RNA鏈的退火，這表明3AB蛋白具有核酸分子伴侶活性[33]。而單獨(dú)的3A和3B都不具備激活3D聚合酶活性和核酸伴侶活性。對(duì)腸道病毒的研究中進(jìn)一步將其活性位點(diǎn)定位到了3A蛋白C末端的7個(gè)氨基酸和3B蛋白所組成的3B+7蛋白，該3B+7蛋白有著幾乎與3AB蛋白相同的核酸分子伴侶活性。由此說(shuō)明3A與3B蛋白的共同作用對(duì)于其核酸伴侶活性是必須的。由于小RNA病毒3A蛋白C端的差別較大，是否其核酸分子伴侶活性位點(diǎn)都集中于3B+7還需進(jìn)一步驗(yàn)證，但可以肯定的是該活性的正常發(fā)揮是需要3A和3B蛋白共同作用的。

3.23A蛋白與GBF1/ARF相互作用小RNA病毒3A蛋白所引起的蛋白運(yùn)輸抑制的主要原因是細(xì)胞的囊泡運(yùn)輸受到了阻礙。囊泡運(yùn)輸受多種因子調(diào)控，大量研究證明3A蛋白主要影響的是囊泡運(yùn)輸中ARF家族蛋白的重排[34]。ARF空間結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，ARF的構(gòu)象上能夠在有活性的ARF-GTP和無(wú)活性ARF-GDP轉(zhuǎn)換[35-36]。當(dāng)ARF結(jié)合GTP后其N末端的α螺旋可以插入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi), GTP-ARF與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合后激活外被蛋白裝配途徑[37]。接下來(lái)外被蛋白的結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并與GTP-ARF相間形成被膜小窩。然后在受體膜上ARF活化磷脂酶D(PLD), 導(dǎo)致了囊泡與靶膜的特異性融合，在與靶膜的融合中囊泡ARF-GTP復(fù)合物和外被蛋白會(huì)被洗脫下來(lái)。但ARF并沒(méi)有GTP 酶的活性, 只有當(dāng)ARF同靶膜上的GTP酶活化蛋白(GTPase-Activating Proteins,GAPs)作用才能使ARF-GTP 轉(zhuǎn)化為ARF-GDP，從而完成整個(gè)循環(huán)。因此ARF家族蛋白不同構(gòu)象的成功轉(zhuǎn)換是細(xì)胞正常蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)。3A蛋白通過(guò)對(duì) GBF1的募集，使得ARF一直處于有活性的ARF-GTP狀態(tài)，而非活性狀態(tài)的ARF-GDP無(wú)法產(chǎn)生，使得囊泡無(wú)法與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合。3A蛋白與GBF1/ARF相互作用，最終使得宿主蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制。

4展望

小RNA病毒入侵宿主后能將宿主的膜改造，然后在被改造后的膜上復(fù)制其自身RNA，并將其積聚在被感細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)里。在整個(gè)過(guò)程中3A蛋白是通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)通過(guò)GBF1抑制ARF家族蛋白的活化來(lái)抑制蛋白的運(yùn)輸，同時(shí)又通過(guò)募集GBF1到膜上形成復(fù)制復(fù)合體完成自身的復(fù)制，這都是不明確的。但是兩者都很清晰地反應(yīng)了，3A蛋白在病毒復(fù)制的整個(gè)過(guò)程中起重要的作用。也有人提出這些膜的改造是由于病毒2BC蛋白與3A蛋白共同作用使得分泌途徑變化，然而具體的機(jī)制尚未被闡明。細(xì)胞中具有很多microRNAs以及其他的宿主蛋白，其中是否存在能影響小RNA病毒3A蛋白功能發(fā)揮的因素還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.016

通訊作者：汪銘書，Email：mshwang@163.com

Corresponding authors: Wang Ming-shu, Email: mshwang@163.com

中圖分類號(hào)：R374

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)02-0177-05

收稿日期：2015-09-21；修回日期:2015-11-26

Research progress in 3a gene of picornaviridae and its encoded protein

ZHANG Sheng-yong,CHENG An-chun,WANG Ming-shu

(Avian Diseases Research Center, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University/KeyLaboratoryofAnimalDiseasesandHumanHealthofSichuanProvince/InstituteofPreventiveVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China)

Abstract:Picornaviridae protein 3A is a non-structural protein of the virus.This article mainly introduced the characteristics of 3A gene and its encoding protein,the role of cell protein transport and interaction with other proteins. ARF family protein and 3A protein in the vesicles transportation synthetically discusses the interaction mechanism and so on.

Keywords:picornaviridae; 3A gene; 3A protein

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