人誘導多能干細胞在藥物肝損傷研究中的應用

陳 潔，湯納平，馬 璟

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203）

人誘導多能干細胞在藥物肝損傷研究中的應用

陳 潔，湯納平，馬 璟

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，國家上海新藥安全評價研究中心，上海201203）

人誘導多能干細胞具有自我更新和分化的多潛能性，其誘導分化的肝樣細胞可應用于藥物發(fā)現(xiàn)、篩選以及藥物肝毒性評價研究。藥物性肝損傷是導致上市藥物被召回和藥物研發(fā)失敗的主要原因之一。臨床前動物實驗因其種屬差異等方面的不足導致藥物臨床研究失敗，浪費了大量人力物力。本文全面總結了人誘導多能干細胞誘導分化的肝細胞在藥物肝毒性評價中的研究應用，希望有助于在藥物研發(fā)過程中準確把握肝毒性，保證人體用藥安全。

多能干細胞；肝損傷；安全評價

在藥物研發(fā)過程中，藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）是藥物開發(fā)終止的首要原因，也是藥物上市后被撤回的主要因素［1］。因此，DILI已成為藥物在研發(fā)階段最為關心的問題之一。雖然在過去幾十年里藥物靶器官毒性研究作為毒理學研究的重要內容已得到了足夠的重視，但藥源性肝毒性的發(fā)生頻率在過去15年并未顯著減少［2］。一個主要原因是動物和人類之間的種屬差異使得藥物在進入臨床研究階段出現(xiàn)非預期的肝毒性而使藥物研發(fā)失敗。因此，開發(fā)安全、有效的臨床前肝毒性早期評價的人源化細胞模型顯得尤為重要。合適的細胞模型不僅可用于藥物安全性評價，也可用于肝毒性藥物的高通量篩選和藥效學研究等。

干細胞技術得到迅速發(fā)展，如是由成熟體細胞重編程而制備誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）。與胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESC）相比，不受倫理道德約束且來源充足，在新藥研發(fā)、毒性篩選和藥物安全性評價中有廣泛的應用前景。

1 人誘導多能干細胞概述

2006年，Yamanaka研究團隊［3］首次通過逆轉錄病毒載體將4種轉錄因子Oct3/4，Sox2，c-Myc和Klf4引入到小鼠胚胎成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)可誘導其發(fā)生轉化，產生一類與ESC有極其類似功能的細胞。這類細胞具有不斷自我更新和分化的多潛能性，從而被命名為iPSC。2007年他們又利用相同的4種轉錄因子成功將人皮膚成纖維細胞重編程為多能性狀態(tài)的細胞［4］。此后，這一研究成果在全世界被廣泛應用。2009年，周琦課題組和高紹榮課題組［5-6］幾乎同時成功獲得完全由iPSC制備的活體小鼠，首次證明了iPSC具有真正的全能性。該研究成果被評為2009年《時代周刊》十大醫(yī)學突破之一。隨著培養(yǎng)條件和轉化效率不斷提高，包括小鼠、人在內的不同種屬動物的各種類型的體細胞均被成功誘導為iPSC。

長久以來，ESC避免不了其細胞來源、倫理道德和宗教信仰的阻礙。而體細胞重編程技術的出現(xiàn)正好解決了這一難題，是干細胞領域的一次巨大革新，同時也為再生醫(yī)學、新藥發(fā)現(xiàn)、藥物篩選及藥物安全性評價等開辟了新的途徑。因而，日本Yamanaka和英國John Gurdon共同獲得2012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

2 人誘導多能干細胞來源的肝細胞樣細胞（hepatocyte-like cells，HLC）的優(yōu)點

目前，用于肝毒性評價的體外細胞模型主要有人原代肝細胞、肝癌細胞系和干細胞系。原代肝細胞一直被視為是最好的用于毒性和代謝研究的體外模型［7］。實際上，原代肝細胞，特別是人源的，通常被認為是藥物肝毒性的“金標準”［8-9］。原代肝細胞雖然能更好地模擬生物肝的功能，但因其獲得耗時費力，且不能進行傳代，不適用于長期反復給藥的研究［10］。另外，肝移植的嚴格流程使得肝細胞來源幾乎不可能是正常人。肝細胞來源于嚴重肝損傷患者或多藥聯(lián)用患者，使得肝細胞的質量低劣［11］。這些不足導致人原代肝細胞的質量和供應數(shù)量都難以保證。同樣，人肝癌細胞系也并不能充分代表正常人肝細胞的多樣性。人肝癌細胞系取材于原發(fā)肝癌組織，其主要特點是可無限傳代，但隨著傳代次數(shù)的增多，其基因型和表現(xiàn)型均發(fā)生變化［12］。其次，人ESC具有正常二倍體核型，能在體外長時間培養(yǎng)和傳代，但其來源有很大爭議，在取材上飽受道德倫理壓力?；谌嗽渭毎⒏伟┘毎岛腿薊SC的不足，人iPSC（human iPSC,hiPSC)就成為了人們關注的熱點。hiPSC有望提供一個可擴展的、基因類型明確的、來源一致的肝細胞類型。目前已有很多iPSC分化為肝細胞的方法［13-14］。近年來，分析hiPSC來源的HLC特征主要包括形態(tài)學和功能學2個方面［15］。形態(tài)學分析顯示，該細胞有圓的細胞核且核仁明顯，有高的質核比，有的還能觀察到雙核和膽微管結構等。在功能學方面，hiPSC來源的HLC能表現(xiàn)出與原代肝細胞類似的關鍵功能，包括細胞膜極性、糖原、脂質、尿素和關鍵肝蛋白（白蛋白、脫唾液酸蛋白受體和α1-抗胰蛋白）的合成。此外，它們還能表達和誘導主要的細胞色素P450酶。因此，利用hiPSC來源的HLC作為藥物肝毒性評價的體外模型，可減少動物實驗帶來的種屬差異［16］，降低藥物研發(fā)成本，縮短研發(fā)周期，提高藥物毒性預測的準確性。

3 誘導多能干細胞定向誘導為肝樣細胞

近年來，對于iPSC定向分化為肝細胞的研究有很多。其中報道最多的是利用肝細胞增殖分化過程中密切相關的細胞因子來誘導。2009年，Song等［17］首次將iPSC誘導分化為肝樣細胞。整個誘導過程通常需要3～4周，總共分為4個階段，分別采用激活素A、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和角質化細胞生長因子作為添加物，最后一個階段添加含有含有抑瘤素M（oncostatin M，OSM）和地塞米松（dexa?methasone，DEX）的N2B27培養(yǎng)基促進細胞成熟。經(jīng)過這一系列的誘導分化，iPSC最終分化為類似肝細胞的上皮樣細胞，這些細胞能分泌糖原、白蛋白和合成尿素，具有可誘導的細胞色素P450酶活性。目前，已有多個研究團隊報道用類似的方法得到肝樣細胞，例如2010年，Rashid等［18］和Si-Tayeb等［19］用類似的方法獲得了肝樣細胞。2012年，Chen等［13］用激活素A、Wnt3a蛋白、HGF、FGF、OSM和二甲亞砜等誘導因子分階段處理iPSC，同樣獲得了和成熟肝細胞有類似功能的細胞。

鑒于iPSC向肝細胞分化的不同階段會表達一些特異基因［20］，因此可通過基因過表達來誘導iPSC向肝細胞分化。2011年，Takayama等［21］將內胚層標志基因Sox17通過腺病毒轉入到iPSC中，促進了iPSC向內胚層細胞分化，同年該研究團隊又利用過表達HEX基因將iPSC誘導為肝樣細胞［22］。目前研究熱門的還有肝富集轉錄因子，它可通過調控特異基因的表達控制肝細胞的分化方向，并維持分化表型［23］。

此外，一些小分子化合物也被用來誘導iPSC形成肝樣細胞。Shan等［24］通過高通量篩選出2個類別的化合物，一類為促進功能增殖化合物，主要起到促進原代肝細胞在體外增殖的作用；另一類為促進功能化合物，它可促進iPSC向成熟樣細胞的分化以及功能的強化。鑒于小分子化合物具有合成簡單、保存方便、細胞通透性好、無細胞免疫性等優(yōu)點，成為了誘導iPSC分化的一種新途徑。如今，三維細胞培養(yǎng)技術的高速發(fā)展也在干細胞誘導分化的過程扮演了越來越重要的角色［25］，相較于二維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，它能最大程度地在體外模擬體內組織的結構和功能，為細胞提供更好的生存環(huán)境，這種技術的發(fā)展極大提高了細胞實驗的準確性。Takayama等［26］對三維微球培養(yǎng)的人ESC和hiPSC來源的肝樣細胞和二維培養(yǎng)的肝細胞的功能進行比較，發(fā)現(xiàn)各項功能指標均優(yōu)于二維培養(yǎng)的肝細胞，并且細胞的功能活性保持時間也更長。

定向誘導分化肝細胞方法日漸成熟，為iPSC在藥物肝毒性評價中體外模型的選擇提供了更多的選擇，提示可利用體細胞重編程技術獲取有增殖分化能力的iPSC，進而再誘導分化iPSC得到成熟肝樣細胞，在藥物開發(fā)早期有效篩查藥物的肝毒性。

4 hiPSC來源的HLC在DILI評價中的應用

由于人源肝細胞不易獲得，而hiPSC來源的HLC在體外可大量獲得，因此，其在藥物肝毒性評價中具有廣闊的應用前景。2009年，Song等［17］首次證明了hiPSC能在體外有效地分化為肝細胞，在某種程度上表明hiPSC來源的HLC很可能適用于DILI評價。Rodrigues等［27］通過對人皮膚前體細胞（human skin-derived precursors，hSKP）進行誘導分化，成功分化出人肝細胞，該肝細胞不僅能表達肝祖細胞標志物如上皮細胞黏附分子和成人肝細胞標志物白蛋白，還能表達關鍵的生物轉化酶和藥物轉運蛋白。該實驗運用毒理基因組學的方法，通過檢測肝損傷、肝細胞增殖、壞死以及肝脂肪變性等指標,證明了在對乙酰氨基酚誘導的肝損傷模型中hSKP誘導的人肝細胞和人原代肝細胞的結果幾乎一致。更值得注意的是，他們還發(fā)現(xiàn)hSKP誘導的人肝細胞中細胞毒性、細胞凋亡相關的基因也普遍上調，而這些基因很有可能是潛在的肝毒性生物標志物。由此看來，hiPSC來源的HLC作為肝毒性模型預測DILI的價值越來越大。

4.1 hiPSC來源的HLC的預測靈敏性

目前已有報道闡述hiPSC來源的HLC的預測靈敏性。通過多毒性終點和讀數(shù)，從明顯影響肝的物質中區(qū)分出已知的肝毒性物質［29-30］。hiPSC來源的HLC對不同種類的化合物，不同毒性機制的藥物靶點都有敏感性，最重要的是能對已知毒性的化合物產生相關的毒性代謝物，如黃曲霉素B1，在足夠濃度條件下可揭示對細胞毒性的影響［28］。Ware等［29］建立了一個hiPSC來源的HLC和胚胎成纖維細胞共培養(yǎng)模型，利用這個模型檢測了47種藥物，其中37種有明確肝毒性，10種無肝毒性。通過多功能終點指標（如白蛋白、尿素和ATP）的判斷，該模型成功鑒別出24個肝毒性藥物，敏感性達到65%，且成功鑒別出10個無肝毒性化合物。Sirenko等［30］利用hiPSC來源的HLC進行高通量篩選藥物肝毒性，他們選用了240個不同肝毒性化合物，其中包括208個有肝毒性的物質，30個無肝毒性物質，2個隨機空白。評價終點包括細胞活性、細胞完整程度、細胞核形態(tài)和線粒體膜電位等。實驗中采用了高通量成像法評估精細的表型變化并提供多參數(shù)輸出，如細胞形態(tài)、細胞黏附和傳播、核固縮、脂質聚集、線粒體電位等。實驗中觀察到絕大多數(shù)參數(shù)的改變有劑量依賴性，隨濃度增加而增加，且隨濃度增加能采集到的點也越來越多。數(shù)據(jù)分析顯示，大部分無毒性物質在相對活性指數(shù)排名較高（細胞活力越大相對活性指數(shù)越高，代表物質毒性越低），而大部分有肝毒性的物質排名相對較低。盡管所有的分析參數(shù)都同等重要，但在數(shù)據(jù)整合過程中還應根據(jù)使用者的需求進行修改，這個分析結果也只能作為半定量分析。

4.2 hiPSC來源的HLC用于長期肝毒性評價

和原代肝細胞相比，hiPSC來源的HLC在培養(yǎng)基中能長期維持其基本活性和功能，這一模型的應用對發(fā)現(xiàn)臨床相關性更大、低劑量長期給藥的化合物毒性作用有重要意義。這種類型的細胞長期給藥方式能更準確地反映人體內藥物的暴露類型，并進一步提高體外毒性測試的預測能力。Ulvestad等［31］比較了干細胞（人ESC和hiPSC）來源的肝細胞與人原代肝細胞以及HepG2細胞中CYP450酶和轉運蛋白的表達水平，他們發(fā)現(xiàn)干細胞來源的肝細胞CYP450酶活性雖不如原代細胞，但其酶活性維持時間更長，可至少維持1周。Holmgren等［32］發(fā)現(xiàn)，hiPSC來源的HLC在長達14 d毒性化合物的暴露下，細胞變得更加敏感。實驗中選用了4個肝毒性化合物（胺碘酮、黃曲霉素B1、曲格列酮和希美拉加群（ximelagatran），以一定的濃度梯度重復給藥2，7和14 d，整個實驗周期監(jiān)測細胞形態(tài)，每個時間點檢測細胞活力以及脂肪變性和磷脂誘導。數(shù)據(jù)結果顯示，hiPSC來源的HLC模型是穩(wěn)定的，足以滿足至少2周的藥物暴露，且能在機制水平評估肝毒性反應的特異性。hiPSC來源的HLC在本實驗的優(yōu)勢在于其可再生性以及長期培養(yǎng)條件下也不會丟失肝細胞表型。上述研究結果提示，hiPSC來源的HLC模型可用于長期肝毒性評價。

4.3 hiPSC來源的HLC用于個體差異毒性評價研究

HiPSC為個性化細胞治療和候選藥物的篩選提供了一個特異性疾病的肝細胞模型［33］。使用hiPSC的另一優(yōu)點在于，它們能用于研究細胞對藥物的遺傳學作用。臨床捐贈者的iPSC表現(xiàn)出對不同的藥物敏感性和代謝酶活性，增加了毒性的預測能力［34-35］。Medine等［35］發(fā)現(xiàn)，不同遺傳背景的hiPSC來源的HLC與人ESC來源的肝細胞相比，只對CYP2D6活化的化合物敏感，而對CYP2C9代謝的化合物不敏感，這是由于hiPSC來源的HLC中CYP2C9基因表達和功能的下降。這表明人群中常見的代謝差異模型的應用或許有一定的可行性。Sjogren等［36］比較了hiPSC來源的HLC、原代凍存干細胞和肝腫瘤細胞系（Huh7和HepaRG）這3種類型的細胞在給予細胞凋亡誘導劑星孢菌素和對乙酰氨基酚處理后的毒性反應。結果發(fā)現(xiàn)，當研究直接誘導細胞凋亡類的藥物時，hiPSC來源的HLC是一個優(yōu)于Huh7和HepaRG及原代凍存干細胞的體外模型。一方面是由于原代凍存干細胞中CYP基因表達和活性能力的維持僅僅48 h，而hiPSC來源的HLC卻能維持1周。另一方面，hiPSC來源的HLC在調控和執(zhí)行細胞凋亡通路分析方面優(yōu)于肝腫瘤細胞系HepaRG，更接近于原代凍存干細胞。然而對于具有更復雜毒性機制的化合物而言，如對乙酰氨基酚，細胞死亡的機制依賴于細胞死亡信號的控制因素和藥物代謝能力之間的平衡，需要考慮選擇一個合適的體外模型。

由基因遺傳多態(tài)性引起肝代謝的個體差異，對個體藥物療效和不良反應均有很大影響。hiPSC來源的HLC有潛力預測的個體在藥物代謝和藥物反應能力的差異性。Takayama等［37］從hiPSC分化出肝細胞，而hiPSC是從人原代肝細胞中轉化而來的。作者比較了hiPSC來源的HLC和起始來源的人原代肝細胞的藥物代謝能力，CYP2D6代謝的個體差異和CYP2D6編碼的基因的多態(tài)性引起的藥物的反應性差異均在hiPSC來源的HLC中重現(xiàn)，這表明它們對個性化藥物治療有重要意義。Alpers Huttenlocher（AHS）綜合征是一種神經(jīng)系統(tǒng)代謝紊亂疾病，由線粒體DNA聚合酶突變引起，并且和丙戊酸肝毒性增加的風險有關。最近有研究表明，從2名AHS患者獲得hiPSC來源的HLC對丙戊酸誘導線粒體依賴性細胞凋亡更敏感，這種效應受線粒體通透性轉換孔開放調節(jié)。此外，與正常hiPSC來源的HLC相比，用丙戊酸孵化的AHS患者hiPSC來源的HLC表現(xiàn)出能激活更多的胱天蛋白酶9和細胞色素c的釋放［38］。這升高的敏感性可解釋AHS患者患丙戊酸毒性的風險提高，也為hiPSC來源的HLC降低丙戊酸毒性提供有效的治療策略［38］?；颊邅碓吹膇PSC提供了一種遺傳病的毒性模型，同時能對明確治療靶點的藥物進行評價［38］。

5 問題與展望

盡管iPSC細胞系的建立技術已發(fā)展得相對成熟，但重編程仍然是一個含有很多未知因素且低效的過程，具體機制尚不明確。iPSC的出現(xiàn)，解決了異源ESC涉及到的倫理問題，對藥物研發(fā)也發(fā)揮了很大的作用。值得關注的是，hiPSC來源的HLC，為體外藥物肝毒性評價細胞模型提供了更廣泛的選擇，但到真正成熟廣泛應用還要做大量的工作。hiPSC來源的HLC還有很多問題需要解決，如改進iPSC誘導方法，提高其產生效率和安全性；提高iPSC向肝樣細胞分化的效率和純度；制定檢測iPSC來源肝樣細胞的標準等。鑒于hiPSC來源的HLC的藥物肝毒性評價更接近于人肝細胞對藥物的反應，國內外許多生物制藥公司都非常重視，近年來與學術界投資或聯(lián)合開發(fā)基于hiPSC的體外系統(tǒng)［39-40］。如法國生物公司Cellectis于2012年就宣布推出源于hiPSC的肝細胞產品，該產品具有同質性、生命周期長、可再生且細胞色素P450活性穩(wěn)定的優(yōu)點，對新藥研發(fā)和毒性測試等體外研究提供了理想平臺。

歐洲委員會和歐盟制藥企業(yè)聯(lián)合倡議的“創(chuàng)新藥物引起的肝損傷”，將可能促進hiPSC來源的HLC在新藥研發(fā)中的應用。綜上所述，雖然iPSC技術仍存在許多瓶頸，不過相信在研究者和政府部門的共同努力下，它必會發(fā)展得越來越好，并將在藥物發(fā)現(xiàn)、篩選、早期毒性評價中扮演越來越重要的角色。

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Application of human induced pluripotent stem cells in drug-induced hepatotoxicity study

CHEN Jie，TANG Na-ping，MA Jing
（China State Institute of Pharmaceutical Industry，National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research，Shanghai 201203，China）

Human induced pluripotent stem cells（hiPSCs）possess self-renewing potency and plu?ripotency and can differentiate into virtually any somatic cell type，such as hepatocytes.The hiPSCsderived hepatocyte-like cells（hiPSCs-derived HLCs）can be used in drug discovery，screening and drug induced hepatotoxicity assessment.Drug-induced liver injury is one of the main causes of drug withdrawals or failure of drug development.Due to species differences in hepatocellular function，unrepresentative results of preclinical animal experiments may lead to the failure of drug development and the waste of human effort and financial resources.This review describes the progress of hiPSCsderived HLCs in drug-induced hepatotoxicity evaluation in the hope of helping to find out more about the liver toxicity in the process of drug development and ensure the safety of human drugs.

pluripotent stem cells；liver injury；safety evaluation

MA Jing，E-mail：jma@ncdser.com

R965.2

A

1000-3002-（2016）11-1219-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.11.014

Foundation item：The project supported by National Natural Science Foundation of China（81273603）；″Technology Innovation Action Plan″Science and Technology Support Project in the Field of Experimental Animal Research (14140900901)

2016-06-22 接受日期：2016-11-04）

（本文編輯：齊春會）

國家自然科學基金（81273603）；“科技創(chuàng)新行動計劃”實驗動物研究領域科技支撐項目（14140900901)

陳 潔，碩士研究生，主要從事肝分子毒理學研究；馬璟，博士，研究員，博士生導師，主要從事藥物毒理學研究。

馬 璟，E-mail：jma@ncdser.com