單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型的主要方法及研究進(jìn)展

劉　健，宋倩倩，翁巧琴，張金枝*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司)

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單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型的主要方法及研究進(jìn)展

劉健1，宋倩倩1，翁巧琴2，張金枝1*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司)

近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，遺傳標(biāo)記也在不斷的發(fā)展與進(jìn)步。目前，基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)已成為繼RFLP，SSR之后的第三代分子遺傳標(biāo)記[1]。

SNP是指在基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等形式，具有數(shù)量豐富，分辨率高，覆蓋基因組范圍大，遺傳穩(wěn)定等主要優(yōu)點。因此，SNP可廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、醫(yī)學(xué)及生物進(jìn)化等相關(guān)領(lǐng)域，作為穩(wěn)定的分子遺傳標(biāo)記從而開展相關(guān)研究。本文主要介紹SNP分型的常規(guī)方法，部分方法的改良及國內(nèi)外SNP分型方法的研究進(jìn)展。

1PCR-SSCP法

DNA的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)是指含點突變的DNA小片段在中性聚丙烯酰胺凝膠中的單鏈電泳遷移率與相應(yīng)正常的DNA小片段的單鏈電泳遷移率明顯不同。

基本原理：經(jīng)PCR擴(kuò)增的DNA片段在變性劑或低離子濃度下，經(jīng)高溫處理使之解鏈并保持在單鏈狀態(tài)下，單鏈DNA遷移率除與DNA長度有關(guān)外，主要取決于DNA單鏈所形成的空間構(gòu)象。因此，含有點突變的DNA單鏈同正常的DNA單鏈相比，其在中性聚丙烯酰胺凝膠中的單鏈電泳遷移率完全不同，即可劃出DNA單鏈中的SNP位點。

操作步驟：PCR擴(kuò)增靶DNA；將特異的PCR產(chǎn)物變性后，迅速冰浴，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；將適量單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率，且與正常對照相比發(fā)生改變，就可判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變。

主要優(yōu)點：可以檢測任何(包括已知和未知)DNA位點上的多態(tài)性和突變；無需事先知道待測DNA片段的序列，只要能根據(jù)已有數(shù)據(jù)設(shè)計PCR引物即可進(jìn)行PCR-SSCP分析；實驗操作簡便，周期短，成本低；更適于功能基因研究[2]。

主要缺點：不能對DNA序列變異進(jìn)行精確定位,只能對其進(jìn)行初篩，當(dāng)DNA片段大于400 bp時容易出現(xiàn)假陰性及假陽性等[3]。

根據(jù)PCR-SSCP基因分型方法，可以很快完成對DNA片段進(jìn)行初步篩選，但也不能忽視其不能精確定位的缺點，針對PCR-SSCP技術(shù)存在的問題，科研人員進(jìn)行了進(jìn)一步探索，采用熒光標(biāo)記PCR-SSCP技術(shù)[4]，限制性內(nèi)切酶指紋SSCP技術(shù)[5]及低離子強(qiáng)度PCR-SSCP技術(shù)[6]，一定程度上改善了PCR-SSCP技術(shù)在應(yīng)用中的問題，提高了檢測效率。

2PCR-CTPP技術(shù)

該技術(shù)又稱四引物擴(kuò)增受阻突變體系，是一種可用于SNP分型的新型技術(shù)。

基本原理:利用Taq DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶校正活性,當(dāng)引物3′末端錯配時延伸效率明顯降低,導(dǎo)致擴(kuò)增受阻；針對已知突變,在突變點兩側(cè)設(shè)計巢式引物:一對外引物和一對特異性內(nèi)引物,內(nèi)引物的3′終末端須落在突變位點上,根據(jù)擴(kuò)增片段的大小和數(shù)量檢測突變是否發(fā)生。PCR-CTPP引物設(shè)計是決定該技術(shù)檢測靈敏度的關(guān)鍵。引物的3′末端堿基必須落在突變位點上,該堿基可與野生型基因序列完全互補(bǔ),而與突變型不匹配；也可與突變型互補(bǔ)而與野生型不匹配,但3′端最后堿基必須在突變位點上,否則就不能準(zhǔn)確判斷突變是否發(fā)生。

主要優(yōu)點：可以快速檢測SNP位點，可準(zhǔn)確找到突變位點，且實驗操作簡便，成本較低。

主要缺點：由于Taq DNA聚合酶具有5′→3′外切酶活性，所有外引物引導(dǎo)的延伸會對同向內(nèi)引物及其延伸產(chǎn)物阻礙其引導(dǎo)擴(kuò)增，破壞其擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。實際應(yīng)用時只能通過控制實驗條件來盡量減小這一缺陷對實驗結(jié)果所造成的影響。針對本技術(shù)存在的缺陷，解決辦法主要是在引物的3′末端倒數(shù)第二位或第三位引入人為錯配可以有效提高SNP分型的特異性,以避免假陽性造成的誤判等[7]。

針對PCR-CTPP技術(shù)，國內(nèi)外科研人員進(jìn)行了大量試驗與創(chuàng)新以提高其檢測的特異性。其中日本名古屋大學(xué)報道的OPA-CTPP技術(shù)[8]，可在常規(guī)PCR-CTPP技術(shù)分型不是非常明顯的情況下采用本法后可得到較為清晰的電泳圖譜。試驗發(fā)現(xiàn)，在使用PCR-CTPP法檢測SNP位點時，由于四個引物的Tm值不同，進(jìn)而引起DNA片段的不平衡擴(kuò)增，導(dǎo)致PCR擴(kuò)增過程中很難產(chǎn)生想要的特定片段。針對該缺陷，名古屋大學(xué)Guang等(2012)[8]在兩對引物的5′末端各加了一段共同序列，并對這一共同序列在反應(yīng)體系中又加入了一個引物，這樣在整個反應(yīng)體系中就存在5個引物，相對于常規(guī)的PCR-CTPP方法增加了一個引物，因此就將此方法命名為OPA-CTPP法。另據(jù)王柯等(2011)[9]報道，其改良PCR-CTPP技術(shù)的方法是在引物設(shè)計時, 使兩個內(nèi)引物的Tm值稍高；在PCR早期循環(huán)中,設(shè)置較高的復(fù)性溫度,抑制外引物的復(fù)性,使內(nèi)引物引導(dǎo)的片段優(yōu)先擴(kuò)增；再降低到折中的復(fù)性溫度進(jìn)行擴(kuò)增。該法主要是減少外引物引導(dǎo)的延伸對同向內(nèi)引物及其延伸產(chǎn)物產(chǎn)生阻害作用，進(jìn)而使試驗結(jié)果更加準(zhǔn)確，以提高SNP的檢出率。

3等位基因特異性雜交(ASH)

該方法主要根據(jù)核苷酸探針和互補(bǔ)的目的片段進(jìn)行雜交時完全匹配和有錯配兩種情況下雜交復(fù)合體穩(wěn)定性的不同而完成SNP位點檢測。包括等位基因特異核苷酸片段分析(ASO)、基因芯片和動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)等。

基因芯片技術(shù)(Genechips)的基本原理是利用寡核苷酸與不同靶序列變異配對的雜交穩(wěn)定性存在著差異，將微電子芯片制造技術(shù)與雜交熒光顯色技術(shù)結(jié)合在一起,在一小塊硅片上高密度地集成上萬乃至更多的探針形成多重寡核苷酸微陣列，通過與目的DNA的雜交顯色反應(yīng)等方法檢測SNP[10]。

動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)其原理是首先將標(biāo)記有熒光染料的探針與目標(biāo)序列進(jìn)行配對,當(dāng)達(dá)到變性溫度時,熒光強(qiáng)度迅速減弱；存在錯配堿基的互補(bǔ)雙鏈變性溫度低于不含錯配堿基的雙鏈；通過測定互補(bǔ)雙鏈的變性溫度可以判斷互補(bǔ)雙鏈中是否含有錯配堿基。

4內(nèi)切酶酶切技術(shù)

該技術(shù)的基本原理是限制性內(nèi)切酶是一種可識別DNA特異位點,并在特異位點進(jìn)行切割的酶類,對特異DNA位點的切割可產(chǎn)生特定相同的片段序列,當(dāng)存在SNP時,堿基的替換可產(chǎn)生或消除限制性內(nèi)切酶的位點從而使酶切產(chǎn)物的大小及數(shù)目存在差異，其中最典型、應(yīng)用最多的技術(shù)是PCR-RFLP(PCR-限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)及引物入侵技術(shù)(Invader assay)，UCAN等。

引物入侵技術(shù)的基本原理是每一反應(yīng)體系包括一對等位基因特異性探針和一條位于待測SNP位點上游的入侵探針縱向雜交到DNA特異區(qū)域。如果等位基因特異性探針與目標(biāo)序列完全互補(bǔ),則與入侵探針的3′端在SNP位點處重疊, 靶特異切割酶就能識別這種三級結(jié)構(gòu)(精確入侵結(jié)構(gòu))并切除5′端,被切除的尾序列帶有熒光標(biāo)記,又可作為入侵探針參加下一輪反應(yīng)。最后,通過檢測熒光信號來區(qū)分等位基因的類型[11]。

UCAN法采用插入一段RNA的DNA作為聚合酶反應(yīng)的引物，引物的3′末端被化學(xué)基團(tuán)封阻，反應(yīng)中用到了RNase H。在進(jìn)行SNP檢測時，若靶DNA和引物中的RNA完全配對匹配，RNase H消化引物RNA部分而去除封阻的3′末端，使DNA聚合酶的延伸反應(yīng)得以進(jìn)行。根據(jù)延伸反應(yīng)進(jìn)行與否就可實現(xiàn)對SNP的檢測。

5質(zhì)譜法

質(zhì)譜法(MS)測定的是DNA分子基本性質(zhì)(產(chǎn)物的分子量)，是最直接的檢測方法，不需任何標(biāo)記物。高分辨率的MS可輕易區(qū)分僅相差一個堿基的DNA分子。另一優(yōu)點是分析每個樣品只需數(shù)毫秒，即使逐個分析每個樣品，檢測通量仍然很高。通過合理的設(shè)計探針，可實現(xiàn)中度的多重化。

MS方法的最大缺點是對分析樣品純度要求苛刻。隨著產(chǎn)品純化過程的改進(jìn)則可克服這一缺點。

6TaqMan ASO(5′nuclease assays)

該技術(shù)主要利用TaqDNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶特性降解下游與累積擴(kuò)增產(chǎn)物退火探針的特點，系統(tǒng)采用3個引物，除2個常規(guī)引物P1和P2外，還有第3個引物P3，其兩端分別用報告劑和淬滅劑標(biāo)記，5′端與可能的SNP配對，3′端被封阻，不能引發(fā)DNA合成，與P1下游1個位點特異序列結(jié)合。擴(kuò)增時Taq酶由P1引導(dǎo)合成新的DNA鏈，到P3時，如果P3與靶DNA完全配對，其外切酶能力逐漸從5′ 端降解P3，使報告染料解離而發(fā)光。

檢測結(jié)果，如果P3的5′與靶DNA有錯配，則不能切割淬滅劑和發(fā)光。將計算機(jī)與TaqMan ASO結(jié)合起來的PCR方法，提高了自動化程度，可使每人每天檢測1000個以上的SNPs[12]。

7其他分型方法

2012年，第三軍醫(yī)大學(xué)的科技人員介紹了一種新型SNP分型方法-Gap-LCR-PCR技術(shù)的改進(jìn)方法[13]，這種方法使SNP分型變得更加快速與經(jīng)濟(jì)。2008年，中國醫(yī)科大學(xué)王瑞恒等介紹了一種基于等位基因特異性PCR原理的SNP分型方法-FLDASFLM-PCR法[14]，這種方法可同時進(jìn)行多位點SNP分型，因此大大提高了SNP的分型效率。

另外，近年來發(fā)展的變性高效液相色譜(DHPLC)、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALD-TOF MS)、動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)等方法也可完成SNP的分型，這些新技術(shù)具有通量高、易于自動化等優(yōu)點，但儀器設(shè)備成本昂貴。

SNP研究是目前人類基因組研究的熱點,其應(yīng)用范圍將更加寬廣,對群體遺傳學(xué)、制藥學(xué)、法醫(yī)學(xué)、癌癥及遺傳性疾病，甚至進(jìn)化研究等都將產(chǎn)生不可估量的影響。目前，SNP分型方法多種多樣。在這些方法中，一部分是發(fā)掘SNPs，而另一部分只能檢測已知但不能發(fā)現(xiàn)新的SNPs。較為理想的SNP檢測方法應(yīng)具備以下優(yōu)點:一是適合于自動化操作,簡便快速；二是分析費用相對較低,所用特殊試劑較少；三是反應(yīng)精密,不純樣品也可進(jìn)行可靠分析；四是數(shù)據(jù)分析簡化,易于自動化；五是反應(yīng)通量大而靈活。當(dāng)然，每種檢測方法都有其優(yōu)點，也都存在著缺點。但到目前為止，還尚未出現(xiàn)符合上述全部條件的理想方法。因此，試驗研究時必須根據(jù)特定情況，選擇最佳方法，爭取最好試驗結(jié)果。隨著現(xiàn)有SNPs檢測技術(shù)的不斷完善及新SNPs檢測技術(shù)的不斷發(fā)現(xiàn)，特別是高通量、低成本和高精度DNA測序新技術(shù)和微陣列技術(shù)，有朝一日將滿足上述標(biāo)準(zhǔn)，大大推動相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。

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收稿日期：2016-01-26

基金項目：浙江省(畜禽)新品種選育重大科技專項(2012C 12906-6)和寧波市科技局資助項目(201201C8000037)

作者簡介：劉健(1990-)，男，山東濰坊人，碩士研究生，主要研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail:liujian1990@zju.edu.cn*通訊作者：張金枝(1966-)，E-mail:zkangizs@zju.edu.cn

中圖分類號：S813.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-7307(2016)03-0012-003