微小RNA在骨質(zhì)疏松癥治療中的作用及機(jī)制的研究進(jìn)展

陳煦 王新力 鄒遠(yuǎn)康 李天, 2 * 趙雄*

1. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科，西安 710032 2. 第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，西安 710032

骨質(zhì)疏松癥的嚴(yán)重性僅次于心腦血管疾病和腫瘤。國內(nèi)骨質(zhì)疏松癥總患病率為12.4%，老年人患病比例超過一半以上，其中，并發(fā)骨折發(fā)生率接近33%。微小RNA(miRNA)是一種廣泛存在于真核生物中，影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡的重要分子，在腫瘤預(yù)后與基因治療、自身免疫疾病中的功能研究、心血管系統(tǒng)疾病及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病診療上有廣泛的應(yīng)用前景。在骨分化與骨再生過程中，miRNA的異常表達(dá)與骨質(zhì)疏松發(fā)生的關(guān)系尤為密切，成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。本文將對(duì)miRNA與骨分化和骨再生相關(guān)機(jī)制做一綜述，旨在為骨質(zhì)疏松癥的臨床治療提供參考。

1 miRNA調(diào)節(jié)骨分化

miRNA是一類廣泛存在于生物基因組中，由內(nèi)含子和編碼基因間隔區(qū)基因編碼、長(zhǎng)度在20～22 nt的單鏈小分子RNA。miRNA5′端2到8位核苷酸可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)靶向結(jié)合mRNA3′端多個(gè)非翻譯位點(diǎn)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用[1]。 目前，關(guān)于miRNA表達(dá)譜的分析方法有多種，如鎖核酸探針PCR，高通量測(cè)序技術(shù)和微陣列分析[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Runx2和其下游分子Osterix是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化重要的特異性轉(zhuǎn)錄因子，也是miRNA作用的主要靶點(diǎn)，miRNA通過與它們相互作用激活或抑制骨的分化。

1.1 miRNA調(diào)控Runx2信號(hào)通路

Runx2即核心結(jié)合因子α1(core-binding factor alpha1，Cbfa1)，是對(duì)成骨細(xì)胞分化和骨質(zhì)形成有重要影響的特異性轉(zhuǎn)錄因子。Runx2可促進(jìn)成骨基因的表達(dá)，包括骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、I型膠原(collagen-1，ColI)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，65%～80%鎖骨或顱骨發(fā)育不全的人存在不同程度的Runx2突變[3]，Runx2基因敲除小鼠成骨細(xì)胞發(fā)育受阻，骨骼發(fā)育不良或缺如[4]。這些表明Runx2參與骨代謝的一些信號(hào)通路，在骨生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要作用。

miRNA可以直接與Runx2相互作用調(diào)控Runx2表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-133可以靶向結(jié)合Runx2的 mRNA，抑制小鼠C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[5]。在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，miR-338-3p可直接作用于Runx2和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)因子2型受體(Fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2)，引起骨質(zhì)疏松[6]。Jeong等[7]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體相關(guān)受體γ(estrogen-related receptor γ，ERR γ)可通過下調(diào)Runx2在前成骨細(xì)胞的表達(dá)活性，抑制成骨細(xì)胞分化。其后續(xù)實(shí)驗(yàn)也表明，ERR γ通過誘導(dǎo)小鼠C3H10T1/2細(xì)胞miR-433表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平直接調(diào)控Runx2，抑制骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)的表達(dá)。另有研究[8]表明，Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1， Smurf1)可通過蛋白酶體途徑降解Runx2，而miR-15b能通過減少骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中Smurf1的表達(dá)間接上調(diào)Runx2的水平。因此，Runx2作為骨質(zhì)疏松的信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，可以與許多上下游分子相互作用，通過“串話(crosstalk)”作用影響骨的生長(zhǎng)發(fā)育。

1.2 miRNA調(diào)控Osterix信號(hào)通路

Osterix(OSX)又稱SP7，是一個(gè)含有鋅指結(jié)構(gòu)的重要轉(zhuǎn)錄因子，屬Kruppel樣家族的SP亞群，其基因敲除小鼠可因骨礦化異常在出生后迅速死亡。研究[9]發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)的小鼠成骨細(xì)胞中，miR-93過表達(dá)可作用于OSX基因，抑制骨礦化過程。據(jù)Li等[10]報(bào)道，miR-143作為多種腫瘤如非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌和乳腺癌的抑制劑，可通過減少OSX的表達(dá)抑制MC3T3-E1向成骨細(xì)胞分化。

miRNA主要作用于OSX基因或OSX mRNA來發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。近期研究[11]表明，miR-145通過減少OSX的表達(dá)，抑制C2C12和MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化。另一項(xiàng)研究[12]用BMP誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)C2C12細(xì)胞內(nèi)的miR-214作為OSX抑制物參與了此過程的調(diào)控。此外，MiR-31可降低OSX mRNA的表達(dá)，抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨發(fā)育[13]。與其類似的一項(xiàng)研究[14]顯示，通過上調(diào)miR-125b表達(dá)和下調(diào)OSX表達(dá)可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖與分化。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)，miR-31，miR-142和miR-138均表現(xiàn)出抑制OSX的表達(dá)，而miR-322明顯上調(diào)OSX水平。

1.3 miRNA與骨代謝信號(hào)間通路之的相互作用

Runx2和OSX的許多上游或下游分子也參與骨分化與代謝，骨的分化與代謝正是這些調(diào)控分子與信號(hào)通路的協(xié)同作用下完成的，即“串話”作用(crosstalk)。BMP是一種屬于TGF-β家族的多功能的生長(zhǎng)因子，可通過Smad依賴的BMP信號(hào)通路刺激間充質(zhì)骨成熟，是一種受Runx2調(diào)節(jié)的成骨誘導(dǎo)劑[16]。BMP信號(hào)可通過Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶細(xì)胞膜受體特異性激活Smad-1，- 5，- 8，并與Smad-4形成配合物，激活轉(zhuǎn)錄過程[17]。Li等研究表明，在MC3T3細(xì)胞中，miR-29b通過抑制TGF-β3以及激活素II型受體(activin receptor 2A，ACVR2A，TGF-β超家族的另一成員)維持Runx2等一些重要轉(zhuǎn)錄因子的正常水平。此外，一些其他經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，如MiR-335-5p通過激活Wnt /β-catenin，促進(jìn)糖原合成酶激酶-3 (glycogen synthase kinase 3，GSK-3)的磷酸化，增強(qiáng)β-catenin轉(zhuǎn)錄信號(hào)，并通過下調(diào)Dickkopf相關(guān)蛋白1(Dickkopf-related protein-1，DKK1)促進(jìn)小鼠C3H10T1 / 2細(xì)胞的成骨分化[18]。除了BMP、TGFβ和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，一些其他信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)、Notch信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路、nell-1信號(hào)通路、 IGF信號(hào)與氧化應(yīng)激信號(hào)通路也在其中發(fā)揮著重要作用，有待進(jìn)一步深入研究。

2 miRNA調(diào)節(jié)骨再生

2.1 尋找合適的再生前體——間充質(zhì)干細(xì)胞

骨骼發(fā)育涉及整個(gè)生命過程，包括骨的生長(zhǎng)，再生和重塑。骨質(zhì)疏松和骨損傷會(huì)導(dǎo)致骨強(qiáng)度的減弱，從而增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于骨質(zhì)疏松及骨折患者的骨修復(fù)，目前研究的首要突破是找到了合適的再生前體：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。間充質(zhì)干細(xì)胞是骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪等間充質(zhì)組織的再生基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)表明，移植后的MSCs可產(chǎn)生胚胎發(fā)育中神經(jīng)外胚層起源的細(xì)胞，如骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等[19]。骨組織的形成始于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，后者可分化為成骨細(xì)胞的前體，再逐漸發(fā)育成熟。在這一發(fā)育過程中，均可檢測(cè)到miRNA在其中發(fā)揮的重要調(diào)節(jié)作用[20]。此外，基因和 miRNA的表達(dá)的檢測(cè)技術(shù)使我們能夠揭示特定miRNA調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向不同細(xì)胞的分化過程，如miR-96、miR-124、miR-199a可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞不同的分化去向[21]。研究也發(fā)現(xiàn)，各種miRNA水平在未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞和分化的骨細(xì)胞之間具有差異，如miR-30c、miR-15b和miR-130b在成骨細(xì)胞中過表達(dá)，其水平明顯高于未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞[22]。

2.2 探索調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)——目標(biāo)基因

骨重建的關(guān)鍵是識(shí)別miRNA的靶基因。有關(guān)靶基因預(yù)測(cè)的生物信息學(xué)技術(shù)產(chǎn)品如pictar-4，5和熒光素酶等檢測(cè)技術(shù)，可為miRNA靶基因的檢測(cè)提供幫助[23]。一方面，經(jīng)典的骨轉(zhuǎn)錄元件如Satb2的抑制分子miR-34b和miR-34c在小鼠主要的成骨細(xì)胞中可同時(shí)被檢測(cè)到[24]。另一方面，許多新的或易被忽視的靶基因如PPAR γ 可被miR-20a和mir-548d-5p抑制。而miR-20a的過表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致Bambi和Crim1基因沉默，無法發(fā)揮正常的生物學(xué)功能[25]。值得注意的是，除了3′UTR區(qū)，miRNA可能在許多天然靶基因的氨基酸編碼序列中發(fā)揮生物學(xué)功能。劉等[26]發(fā)現(xiàn)，CDS和3′UTR等靶向目標(biāo)能有效地被miR-15a / miR-16和miR-92a抑制。Tay等[27]研究發(fā)現(xiàn)：miR-134能靶向結(jié)合性別決定區(qū)Y相關(guān)的HMG盒2，miR-296能靶向結(jié)合基因的同源異型盒和miR-470能特異結(jié)合八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(Oct4，也稱POU結(jié)構(gòu)域第5類轉(zhuǎn)錄因子1)。這些miRNA均作用于編碼區(qū)，共同促進(jìn)維甲酸對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用。此外，除了轉(zhuǎn)錄后控制的mRNAs，miR-2861已被證實(shí)結(jié)合HDAC5 mRNA的CDS，而miR-3960已被證實(shí)能與Hoxa2 mRNA CDS相互作用[28]，且miR-93表達(dá)對(duì)Osterix mRNA的CDS抑制性效果也通過熒光素酶報(bào)告基因分析得以驗(yàn)證[29]。

2.3 控制細(xì)微的調(diào)節(jié)過程——誘導(dǎo)阻遏因子

鑒于目前已有的發(fā)現(xiàn)，通過影響骨相關(guān)的miRNA的表達(dá)水平能夠調(diào)節(jié)骨修復(fù)和再生。進(jìn)一步的研究方向應(yīng)該集中在如何通過調(diào)控miRNA在基因水平的表達(dá)作用來影響骨骼發(fā)育。通常采用的方法是使用抗miRNA的分子阻礙這些目標(biāo)蛋白編碼基因的啟動(dòng)子，抑制那些靶向蛋白編碼基因的表達(dá)[30]。目前，一類新構(gòu)建的化學(xué)修飾、膽固醇結(jié)合的單鏈RNA類似物可用于結(jié)合互補(bǔ)的miRNA。Ebert和他的同事發(fā)明了一種新型miRNA抑制劑，可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，他們稱之為“miRNA海綿”[31]。Qureshi等[32]使用了一個(gè)銀納米粒子復(fù)合物光活化miR-148b模擬傳遞，成功誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化。另一項(xiàng)研究[33]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞穿透性肽(cell penetrating peptides，CPP)富含精氨酸，可通過介導(dǎo) miR-29b在細(xì)胞內(nèi)作用，促進(jìn)hMSCs向成骨細(xì)胞分化。這些成果的發(fā)現(xiàn)為骨質(zhì)疏松及骨折等多種復(fù)雜疾病的修復(fù)治療帶來了前景，將成為未來研究靶向藥物治療的研究熱點(diǎn)。

3 述評(píng)

綜上所述，骨質(zhì)疏松癥是一種病因復(fù)雜，治療困難的疾病；其分子機(jī)制涉及遺傳基因、信號(hào)通路、激素及旁分泌因子等。目前研究試圖通過影響miRNA調(diào)節(jié)骨分化的過程實(shí)現(xiàn)骨再生的方案主要存在兩方面的問題，其一是雖然在miRNA調(diào)節(jié)骨分化的機(jī)制方面已取得一定進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了與成骨細(xì)胞分化相關(guān)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，但骨質(zhì)疏松的發(fā)病與破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)，骨代謝不平衡等多種因素有關(guān)。在這些異常生理現(xiàn)象中，關(guān)于miRNA具體機(jī)制的研究為數(shù)不多，有待進(jìn)一步探究?？上驳氖?，近期低氧誘導(dǎo)因子、血小板源生長(zhǎng)因子、蛋白激酶B、局部粘著斑激酶等新的信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)，為我們尋求miRNA在骨質(zhì)疏松治療上提供了新的路徑，如目前新發(fā)現(xiàn)的miR-214就是通過調(diào)控Akt通路來影響骨代謝過程[34]。其二是在干細(xì)胞的骨再生領(lǐng)域，以miRNA為基礎(chǔ)的骨骼再生是否能應(yīng)用于體內(nèi)骨再生。miRNA這種新興療法可能存在很多潛在的安全性問題。由于每個(gè)細(xì)胞的miRNA都能夠調(diào)控上百種基因的表達(dá)，因此miRNA途徑的微小失調(diào)也會(huì)對(duì)骨骼造成非常嚴(yán)重的后果。目前miRNA的在臨床應(yīng)用遇到的瓶頸是給藥途徑、給藥濃度上的問題。雖然Eskildsen 等[35]在構(gòu)建的非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石/磷酸三鈣(HA/TCP)與anti-mir-138分子填充骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)骨形成。但這種模擬或干擾miRNA研究多基于細(xì)胞株及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，所用的miRNA濃度并非正常生理?xiàng)l件下的人體內(nèi)的miRNA濃度，所以其具體相關(guān)性功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。