線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型的體會(huì)*

李賽群 陳鈺瑩 廖 玲 周有君 楊 純 潘 江 章 薇

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

·薪火傳承·

線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型的體會(huì)*

李賽群 陳鈺瑩 廖 玲 周有君 楊 純 潘 江 章 薇△

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型被普遍認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，具有無需開顱、損傷小、可重復(fù)、缺血時(shí)間可控、梗阻部位較明確、腦缺血損傷程度較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管疾病的研究。筆者結(jié)合實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)和既往的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型談幾點(diǎn)體會(huì)，以供同仁參考。

動(dòng)物模型 線栓法 大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注

近年來，缺血性腦血管疾病成為嚴(yán)重危害現(xiàn)代中老年人健康的疾病之一，而利用動(dòng)物模型探索缺血性腦血管疾病發(fā)病的可能機(jī)制，努力探尋本病的有效治療方法和藥物是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究亟待解決的問題。建立一種最接近人類腦缺血的理想腦缺血模型對(duì)于研究腦缺血病理機(jī)制和防治措施有著重要意義［1］。線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注（MCAO/R）模型被普遍認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停?］，具有無需開顱、損傷小、可重復(fù)、缺血時(shí)間可控、梗阻部位較明確、腦缺血損傷程度較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管疾病的研究。現(xiàn)筆者結(jié)合實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)和既往的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型談幾點(diǎn)體會(huì)，以供同仁參考。

1 動(dòng)物的選擇

1）動(dòng)物品系。嚙齒類動(dòng)物鼠、兔、狗、猴等均可以用于線栓MCAO的制作。因該類動(dòng)物與人類有相似的中樞神經(jīng)系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)及卒中后病理生理改變，其中，大鼠基因與人類的基因有98%的同源性，還有具有廉價(jià)易于購買、種系內(nèi)純性好、同系大鼠間遺傳差異小、有較強(qiáng)的抗感染能力、生命力強(qiáng)和成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于腦缺血的研究。有研究者發(fā)現(xiàn)［3］，雌激素具有神經(jīng)保護(hù)作用，故該模型多選用雄性的大鼠。常用的有SD大鼠和Wistar大鼠，Markgmf等［4］用光化學(xué)法腦缺血模型比較了這兩種大鼠的梗死情況，發(fā)現(xiàn)SD大鼠梗死體積大于Wistar大鼠，且變異較小。此外，國內(nèi)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)SD大鼠生命力旺盛、頸部血管顯示清晰，易于手術(shù)操作，手術(shù)中出血少，動(dòng)物模型成功率高［5-6］。因此對(duì)于腦缺血模型的選擇SD大鼠優(yōu)于Wistar大鼠。2）體質(zhì)量和鼠齡。目前多主張大鼠體質(zhì)量控制在250～300 g。體質(zhì)量和鼠齡過小，大鼠的血管偏細(xì)，造模時(shí)魚線不容易插入，且鼠齡越小，大鼠對(duì)造模手術(shù)的耐受性差，術(shù)后容易死亡；體質(zhì)量超過300 g的大鼠血管增粗，魚線不能充分阻斷血流而導(dǎo)致造模不成功。

2 術(shù)前準(zhǔn)備

1）術(shù)前飲食。對(duì)于術(shù)前的飲食，國內(nèi)的主流觀點(diǎn)是術(shù)前禁食不禁水［7-8］，而筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠在造模手術(shù)完成后前3 d，精神狀態(tài)較差，飲食量很少，術(shù)后容易出現(xiàn)營養(yǎng)不良使死亡率提高。有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)腦對(duì)缺血再灌注損傷的耐受程度與術(shù)前體內(nèi)的葡萄糖濃度密切相關(guān)［9］，葡萄糖濃度低于正常水平可導(dǎo)致缺血再灌注動(dòng)物的神經(jīng)元損傷加重。故筆者主張術(shù)前后予自由攝食，可提高大鼠對(duì)缺血再灌注的耐受能力，減少術(shù)后死亡率。2）麻醉藥物的選擇。常用的麻醉藥物有水合氯醛、乙醚和巴比妥類等，因乙醚麻醉難以控制造模動(dòng)物的麻醉深度和時(shí)間，作用時(shí)間較短，需持續(xù)給藥，并且揮發(fā)的氣體對(duì)呼吸道有明顯的刺激，一般不宜選用。戊巴比妥鈉［10］對(duì)呼吸中樞有較強(qiáng)抑制作用，容易引起喉痙攣和支氣管痙攣而導(dǎo)致動(dòng)物死亡，因此筆者在研究中采用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，該麻醉藥具有麻醉深度易掌控、麻醉劑量小、副作用小、易于操作、價(jià)廉、配制儲(chǔ)存簡(jiǎn)便易行的特點(diǎn)。麻醉劑的使用過程中應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)：第一，嚴(yán)格按比例現(xiàn)配現(xiàn)用，并注意避光保存；第二，在抓取大鼠麻醉時(shí)，不能用力過度而導(dǎo)致大鼠不適掙扎，容易出現(xiàn)麻醉后死亡，盡量用柔和而又有效的力度抓取大鼠；第三，麻醉進(jìn)針點(diǎn)選在大鼠腹直肌左側(cè)0.5 cm的位置，盡量不要在腹直肌右側(cè)進(jìn)針，以防刺中右側(cè)的肝臟；第四，按大鼠體質(zhì)量給予麻醉劑量。由于水合氯醛的有效劑量和死亡劑量之間的區(qū)間很窄，故有研究人員提出首劑量可給予全劑量的4/5，以防出現(xiàn)麻醉后死亡。而我們發(fā)現(xiàn)，只要麻醉的時(shí)候大鼠無激烈的掙扎，按大鼠體重給予全劑量麻醉劑并未出現(xiàn)死亡，這樣做的目的在于防止大鼠術(shù)后過度活動(dòng)而影響魚線的位置，甚至導(dǎo)致魚線脫出而使造模不成功。若麻醉不完全，可根據(jù)麻醉的深度相應(yīng)予以劑量，每次0.1～0.2 mL即可。

3 線栓的制備與插線的深度

1）線栓的制備。線栓是制備大鼠局灶性缺血模型非常關(guān)鍵的材料，線栓直徑應(yīng)與頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)徑大小相適應(yīng)才能最充分阻斷進(jìn)入大腦中動(dòng)脈的血流。我們購買北京西濃科技有限公司的成品，魚線是柔韌適度的單絲尼龍線，直徑為0.26 mm，其頭端燒熔為半球形，直徑為（0.36±0.02）mm，表面光滑，易進(jìn)入顱內(nèi)又不至于刺破血管，前端20 mm包被多聚-L-賴氨酸，且不改變線栓的直徑，線栓包被多聚-L-賴氨酸可以提高模型的穩(wěn)定性，距離頭端19～20 mm處做好標(biāo)記，已消毒。購買成品魚線使規(guī)格更為一致，對(duì)模型的影響因素更小。（2）插線的深度。Zarow等［11］采用體質(zhì)量280～320 g SD大鼠，發(fā)現(xiàn)從頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）起始處進(jìn)入深度22 mm，比進(jìn)入18 mm能更可靠地產(chǎn)生神經(jīng)功能障礙和缺血損傷。國內(nèi)也有研究者［12］解剖證實(shí)250～300 g大鼠頸總動(dòng)脈分叉處到大腦中動(dòng)脈根部的距離約為13～14 mm?；诖?，筆者最終采用的插入深度為從頸總動(dòng)脈（CCA）分叉插入20 mm，即把標(biāo)記送入分叉處，感覺有阻力時(shí)即停止插入，并向外稍拉出少許即可。此外，在插線時(shí)還應(yīng)注意盡量固定一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員來完成，以避免實(shí)驗(yàn)人員之間個(gè)體化的操作而造成模型之間的差異過大，保證模型的穩(wěn)定性。

4 模型制備

1）手術(shù)器械。由于大鼠的神經(jīng)和血管比較細(xì)，因此在造模時(shí)應(yīng)選擇精密度較高的手術(shù)器械，如剪血管時(shí)可以用眼科角膜剪，這種器械刀尖精小而又鋒利，可在血管上剪合適大小的口子又能避免將血管剪斷，可以很大程度上縮短手術(shù)時(shí)間，提高造模成功率。2）手術(shù)切口。手術(shù)的切口有頸部正中切口及頸側(cè)部切口兩種，我們?cè)趯?shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)：正中切口依次要經(jīng)過頜下腺、頸部淋巴結(jié)、胸骨舌骨肌、二腹肌等，手術(shù)開口較深、視野受限，分離迷走、交感神經(jīng)的難度較大，且對(duì)氣管的機(jī)械刺激較大，而右側(cè)頸部切口較正中切口更容易進(jìn)行肌肉與血管的分離，手術(shù)視野暴露較好，出血少，對(duì)組織的損傷較小。由于左側(cè)迷走神經(jīng)直接分布于心臟，對(duì)心臟功能產(chǎn)生影響比較大，采用頸部右側(cè)切口可減少腦外因素的影響［13］，因此我們不選左側(cè)切口。3）線栓的插入位置與走向。主要有頸外動(dòng)脈（ECA）插入和頸總動(dòng)脈（CCA）插入兩種，頸外動(dòng)脈插入法難度較大，操作過程中容易將血管拉斷，而頸總動(dòng)脈插入法較前者易施行，手術(shù)操作簡(jiǎn)單、不刺激氣管、對(duì)血管的機(jī)械刺激僅局限在頸總動(dòng)脈，對(duì)生理結(jié)構(gòu)的損傷?。?4］，故我們選擇頸總動(dòng)脈插入法。結(jié)扎頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈近心端，并在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和頸內(nèi)動(dòng)脈各放一根活線，待魚線插入后固定魚線用，魚線走向即從頸總動(dòng)脈插入，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈入顱，至大腦前動(dòng)脈，再往回拉約2 mm即至大腦中動(dòng)脈口，使線栓的標(biāo)記剛好在頸總動(dòng)脈分叉口處，記錄開始腦缺血時(shí)間。4）縫合。由于術(shù)后需要再灌，故縫合的時(shí)候宜將多出的魚線頭埋在大鼠體內(nèi)，不宜留在體外，因?yàn)槁樽聿怀浞值拇笫笮g(shù)后過度活動(dòng)有可能改變魚線的位置甚至使魚線脫出而導(dǎo)致造模失敗。

5 術(shù)后再灌與護(hù)理

1）術(shù)后再灌。國內(nèi)有研究人員［15］發(fā)現(xiàn)，術(shù)后24 h對(duì)不同灌注時(shí)間的MCAO大鼠進(jìn)行評(píng)分，MCAO再灌注30 min和60 min未能引起小鼠明顯的神經(jīng)功能障礙，而再灌注90 min及120 min可引起小鼠明顯的神經(jīng)功能障礙，小鼠均出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體癱瘓，主要是前肢；TTC染色顯示：再灌注30～60 min僅形成很小的腦梗死灶，且梗死灶大小變異較大，而再灌注90 min和120 min小鼠腦切面均可見明顯的蒼白色梗死區(qū)，與正常的腦組織界線較明顯，但前者梗死灶周圍的半影區(qū)明顯多于后者，其梗死灶的大小又明顯小于前者，而且其恒定性明顯差于后者，故我們選擇腦缺血后120 min再灌。將大鼠仰臥位捆綁，剪開縫合的皮膚，將魚線緩慢拔出1 cm左右，觀察無出血后涂抹少量青霉素以預(yù)防感染，分層縫合傷口，對(duì)皮縫合好之后再用乙醇消毒2遍。2）術(shù)后護(hù)理。更換鼠籠墊料，再鋪上無菌巾，將完成造模的大鼠置于鼠籠內(nèi)，用烤燈照射直至大鼠完全蘇醒。術(shù)后3 d內(nèi)大鼠精神狀態(tài)較差，自主活動(dòng)較少，故可在鼠籠內(nèi)放少量飼料，防止大鼠過度饑餓。每2日更換一次墊料，以保持鼠籠干燥清潔，減少環(huán)境造成的感染因素。

6 術(shù)后并發(fā)癥與處理

MCAO大鼠常見的術(shù)后并發(fā)癥有死亡、感染、癲癇、腹瀉等。1）死亡。大鼠在術(shù)后24～48 h最容易死亡［16-17］，腦水腫是原因之一；另外，分離血管的時(shí)候損傷迷走神經(jīng)容易導(dǎo)致大鼠窒息死亡；插線過程中用力過猛，刺破顱內(nèi)血管導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血，血凝塊廣泛地凝結(jié)在軟腦膜毛細(xì)血管表面，影響腦微循環(huán)也是導(dǎo)致死亡的原因之一。因此實(shí)驗(yàn)人員在造模過程中動(dòng)作一定要輕柔，切忌用蠻力操作。2）感染。最常見的是眼部感染和尿路感染。眼部感染的大鼠可用紅霉素眼膏外涂，每日1次，連續(xù)使用3～5 d可緩解；尿路感染的大鼠則可予腹腔注射青霉素4萬U/只，每日1次，同時(shí)關(guān)注大鼠的飲水量，如自主飲水次數(shù)明顯減少，可予1%的葡萄糖水灌胃，3～5 mL/只，每日2次。3）癲癇。其發(fā)生機(jī)制可能由于腦缺血后壞死的神經(jīng)元過多，從而影響腦部神經(jīng)元異常放電引發(fā)癲癇。對(duì)于癲癇的大鼠，我們均不納入實(shí)驗(yàn)，及時(shí)予以麻醉處死。4）腹瀉與消瘦。其產(chǎn)生可能與室溫過低、亞低溫?fù)p傷、感染等直接相關(guān)，可在大鼠飲用水內(nèi)加入適量諾氟沙星抗菌治療。腹瀉時(shí)間過久的大鼠大多消瘦，可予1%的葡萄糖水灌胃補(bǔ)充營養(yǎng)，防止大鼠因營養(yǎng)不良而死亡。

7 結(jié) 語

大鼠中大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注模型是研究當(dāng)下缺血性腦血管疾病的重要手段之一，隨著研究的不斷深入，其造模的方法也在不斷改進(jìn)和完善當(dāng)中。由上文可知，線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血模型也并非完美無缺，仍然存在一些局限性。如不同批次的大鼠的耐受性不同，同樣的插線深度，有的大鼠會(huì)造模成功，出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，而有的大鼠并無神經(jīng)功能缺損癥狀等等。除此之外，MCAO大鼠模型造模手術(shù)屬于精細(xì)手術(shù)，造模難度相對(duì)于其他手術(shù)偏大，術(shù)中容易出現(xiàn)各種操作不當(dāng)而導(dǎo)致造模失敗。因此，進(jìn)一步完善MCAO/R模型的各個(gè)環(huán)節(jié)，使之更接近于人類腦血管發(fā)病過程，同時(shí)使得操作簡(jiǎn)單，容易復(fù)制、成功率高、模型穩(wěn)定是我們今后應(yīng)該深入研究的方向。

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Experience on Preparing the Model of Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion in Rats by Thread Embolism Method

LI Saiqun，CHEN Yuying，LIAO Ling，et al.

The First Affiliated Hospital of Hu-nan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

The occlusion reperfusion model of middle cerebral artery in rats is widely believed to be the standard focal cerebral ischemia animal model.It is widely used in ischemic cerebral vascular diseases with no need of craniotomy，little damage，controllable，controllable time of ischemia，definite obstruction site and stable cerebral ischemia.Based on the actual operation experience and previous literature reports，the author would talk about some experience in regard to the line bolt method to prepare the middle cerebral artery ischemia reperfusion model in rats for reference.

Animal model；Thread embolism method；Middle cerebral artery occlusion and reperfusion

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273861，81473754）；湖南省教育廳科技項(xiàng)目（14C0852）

△（電子郵箱：507395550@qq.com）

R743

A

1004-745X（2016）11-2058-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.11.012

（2016-03-15）