2015年國內(nèi)外蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全研究進(jìn)展（續(xù)）

張文文　周金慧　金　玥　張金振　趙文　王琳　李熠　趙靜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京100093）

2015年國內(nèi)外蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全研究進(jìn)展（續(xù)）

張文文周金慧金玥張金振趙文王琳李熠趙靜

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，北京100093）

（續(xù)《中國蜂業(yè)》2016年第3期）

Du等［10］的研究中，建立起含有糖漿標(biāo)志物的特定色譜和質(zhì)譜的信息的小規(guī)模的數(shù)據(jù)庫，并確定飛行時間的一種簡單，快速，有效的超高效液相色譜/四極質(zhì)譜儀（UHPLC/Q-TOF-MS）方法對摻假蜂蜜進(jìn)行檢測。在玉米糖漿、高果玉米糖漿、轉(zhuǎn)化糖漿和大米糖漿的摻假蜂蜜中；多糖、雙果糖酐和2-乙?；秽?3-吡喃葡糖苷用作檢測標(biāo)記。用所建立的方法，可在30 min內(nèi)快速、便捷地檢測出摻假糖漿含量大于10%的蜂蜜。

Wang等［11］根據(jù)淀粉糖漿和純蜂蜜高效液相色譜圖中糖類物質(zhì)出峰時間的不同鑒別糖漿摻假。在糖漿HPLC色譜中，保留時間為15.25 min時出現(xiàn)一個特征峰，但是在純蜂蜜樣品中，相同的保留時間上并沒有峰出現(xiàn)?；趩翁?、二糖和寡聚糖在色譜圖中聚合度為3～7的色譜峰的原則，淀粉糖漿中的此特征峰被鑒定為低聚糖的聚合度大于5的重疊峰。因此，保留時間為15.25 min的特征峰可以作為一個糖漿摻假蜂蜜的HPLC分析標(biāo)記物。開發(fā)的高效液相色譜法應(yīng)用于100多個商業(yè)蜂蜜的摻假檢測檢查，該方法的檢測精度更高，簡便，成本低，便于應(yīng)用于實(shí)踐中，相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)可以普及HPLC設(shè)備和技術(shù)到蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

Marc Spiteri等［12］使用核磁共振譜（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy，NMR）耦合合適的定量方法和統(tǒng)計模型，同時檢查單花蜜和雜花蜜的真實(shí)性。研究使用一個涵蓋大部分經(jīng)濟(jì)作物和地理起源的800種蜂蜜基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集，其中典型的植物花蜜標(biāo)記可以用于檢查單花花蜜；通過光譜圖變化建立起雜花蜜標(biāo)簽；通過200種商品蜜的數(shù)據(jù)統(tǒng)計比較，確定了糖漿標(biāo)記信號。雖然該方法只是定性方法，但是相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)糖漿水平在10%以上時，該方法穩(wěn)定可靠。采用相同的NMR方法，優(yōu)化相關(guān)參數(shù)后進(jìn)行了葡萄糖、果糖、蔗糖和5-羥甲基糠醛定量。

2.5活性成分分析

蜂產(chǎn)品中主要含有蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素、有機(jī)酸、色素、芳香物質(zhì)的高級醇、膠質(zhì)物、蜂花粉、激素等。此外，蜂蜜是一種糖類的飽和溶液，其中糖類約占3/4；蜂王漿中蛋白質(zhì)約占干物質(zhì)的50%，10-羥基-癸烯酸（10-HDA）是蜂王漿中所特有的活性物質(zhì)；蜂膠中含有大量的酚酸和黃酮類物質(zhì)等。多年來，使用不同的儀器方法分離檢測、鑒定分析蜂產(chǎn)品中已知或未知功能的活性成分，確定其在蜂產(chǎn)品中的含量分布，一直是蜂產(chǎn)品活性成分分析研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

Li等［13］開發(fā)NBD-F柱前衍生，高效液相色譜配合熒光檢測的方法分析蜂蜜中的脯氨酸。為了確定不同蜂蜜樣品中的游離脯氨酸，蜂蜜樣品首先用0.1mM硼酸鹽緩沖溶液作為萃取溶劑進(jìn)行超聲萃取，經(jīng)XDB C18柱（150×4.6 mm內(nèi)徑）分離，水相為甲醇：0.1mM乙酸鈉緩沖液（pH 7.2）：四氫呋喃（900∶95∶5，分別，v/ v/v），有機(jī)相為甲醇，流速1.0 ml/min，運(yùn)行時間為10 min。該方法的線性范圍為0.15～100.00 μg/ml，檢出限為3.00 mg/kg，回收率大于90%，日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%。該方法成功運(yùn)用于實(shí)際樣品中，檢出游離脯氨酸含量為80.5～426.4 mg/kg。

H Kaygusuz等［13］通過蜂蜜中礦物質(zhì)和維生素B2、總酚含量和抗氧化活性表征安納托利亞石楠花蜂蜜。采用電感耦合等離子體-發(fā)射光譜法（ICP-OES）對20個蜂蜜樣品中的五種礦物質(zhì)——鈣，鉀，鐵，銅和錳進(jìn)行測定；采用毛細(xì)管電泳色譜配合熒光檢測器測定維生素B2；采用福林-喬卡梯奧法對總酚含量進(jìn)行測定；通過銅降低抗氧化能力試驗(yàn)（CUPRAC）和總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS）檢測蜂蜜的抗氧化能力。石楠花蜂蜜具有較高含量的維生素B2和礦物質(zhì)元素，同時與橡樹花蜜和板栗花蜜相比，石楠花蜜具有更高的抗氧化能力和錳含量，同時，采用主成分分析將石楠花蜂蜜與其他蜜源蜂蜜進(jìn)行了區(qū)分。

新西蘭的麥盧卡蜂蜜以其優(yōu)異的抗菌活性而著稱，這主要?dú)w功于其活性成分甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）。MGO是在麥盧卡蜂蜜成熟過程中由二羥基丙酮（Dihydroxyacetone，DHA）通過非酶脫水形成。MGO和DHA化學(xué)穩(wěn)定性不高，易發(fā)生各種獨(dú)特的化學(xué)反應(yīng)，如通過Strecker反應(yīng)生成一個重要的芳香化合物——2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）。J Ru ckriemen等［15］首次使用液液萃取和氣相色譜-質(zhì)譜分析麥盧卡蜂蜜中的2-AP，使用標(biāo)準(zhǔn)品和人造蜂蜜外標(biāo)法定量。在11個麥盧卡蜂蜜商業(yè)樣品中，2-AP濃度范圍為0.08～0.45 mg/kg。與非麥盧卡蜂蜜相比，含有MGO濃度大于250 mg/kg的麥盧卡蜂蜜中，2-AP含量也顯著較高。當(dāng)高含量MGO被人工添加到雜花蜂蜜中，37℃溫度下儲存12周后，2-AP濃度增加0.07～0.40 mg/kg，同時，5-羥甲基糠醛（HMF）濃度相應(yīng)增大。當(dāng)儲存溫度變化時，2-AP濃度并沒有顯著變化。最終結(jié)果表明，2-AP與MGO的總含量是麥盧卡蜂蜜質(zhì)量控制的一個重要參數(shù)。

核苷、核苷酸和核酸堿基是存在于蜂王漿（royal jelly，RJ）中的發(fā)揮生理活性和生物活性的三種主要物質(zhì)。Wu等［16］開發(fā)一種HPLC法用于同時確定在蜂王漿中的核苷酸、核苷和核堿基，并且調(diào)查三種物質(zhì)在新鮮蜂王漿和商品蜂王漿樣品中的含量和分布差別。方法的檢出限和定量限分別為12.2～99.6 ng/L和40.8～289.4ng/L，回收率均近100.9%。除尿酸外，其他化合物均在蜂王漿中被檢測到。核苷酸、核苷和核堿基的平均含量在新鮮蜂王漿（2682.93 ng/kg）和商品蜂王漿（3152.78 ng/kg）中存在顯著差異，新鮮蜂王漿和商品蜂王漿中普遍存在AMP，腺苷和腺嘌呤，其中新鮮王漿中含量水平較高的是ATP，ADP和AMP，而商品蜂王漿樣品中IMP，尿苷，鳥苷，胸苷的含量相對較高。所研究的化合物可被用作評估蜂王漿新鮮度和質(zhì)量的指標(biāo)。

2.6環(huán)境激素

環(huán)境激素主要通過污染食品、飲用水及空氣來威脅人類健康。該類物質(zhì)在環(huán)境中難以分解，易在生物體內(nèi)蓄積，極易通過食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行生物富集，環(huán)境中不易檢測的微量或衡量環(huán)境激素經(jīng)過3～4個營養(yǎng)級的富集即可達(dá)到驚人的濃度。截至目前，已經(jīng)列入環(huán)境激素的化學(xué)物質(zhì)有70余種，其中對食品和農(nóng)產(chǎn)品污染最為嚴(yán)重、世界各國最為關(guān)注的主要有：制造碳酸醋樹脂的雙酚A（Bisphenol A，BPA）、用于電器產(chǎn)品的多氯聯(lián)苯（Polychorinated biphenyls，PCBs）、農(nóng)藥滴滴涕（Dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT）、塑料增塑劑中的鄰苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）、鋅、鉛、汞等。蜂產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲存、運(yùn)輸和銷售各個環(huán)節(jié)都有可能受到環(huán)境激素的污染，雖然環(huán)境污染的不斷加重，蜂產(chǎn)品中環(huán)境激素類污染物的分離檢測成為近兩年來蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全分析領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

氯酚類物質(zhì)（chlorophenols，CPs）是廣泛存在于水環(huán)境中的污染物質(zhì)，其主要來源為工業(yè)排放的廢水和廢棄物的浸出液、農(nóng)藥、消毒劑和防腐劑等。氯酚是多種含氯酸和有機(jī)磷農(nóng)藥的降解產(chǎn)物。2，4-二氯酚，2，4，6-三氯酚和五氯酚等氯酚類化合物毒性高，污染面廣，難以降解，因此被美國環(huán)保局（U.S.Environmental Protection Agency，EPA）和我國國家環(huán)?？偩至腥雰?yōu)先控制污染物的黑名單。Fan等［17］開發(fā)原位生成離子液體-分散液液微萃?。╥n-situ ionic liquid-dispersive liquid╞liquid microextraction，IL-DLLME）作為預(yù)處理方法，高效液相色譜法測定蜂蜜中氯酚。由親水性離子液體1-丁基-3-甲基-咪唑四氟硼酸鹽（［C4mim］BF4）和離子交換試劑雙（三氟甲基磺酰）亞胺金屬鹽LiNTf2制得疏水性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲基磺酰胺酸鹽（［C4MIM］NTf2）作為從蜂蜜中提取CPs的萃取劑。然后將分析物富集反萃取到40 μl的0.14MmolNaOH溶液中，最后用高效液相色譜法進(jìn)行分析。該方法的富集系數(shù)高，檢測限為0.8～3.2μg/L，回收率為91.60～114.33%，同時簡便、快速、環(huán)保，并且具有較高的提取效率。

BPA在食品包裝領(lǐng)域的用途主要有兩個方面：（1）制備添加BPA的塑料包裝和容器，使得它們具有耐高溫、抗輻射、防沖擊性等優(yōu)點(diǎn)；（2）添加BPA在金屬容器內(nèi)壁化學(xué)涂層中，防止因內(nèi)容物的接觸而引起的金屬容器腐蝕。因此，BPA被廣泛用于食品級包裝材料中，并一直廣受人們的青睞。Mir Ali Farajzadeh等［18］開發(fā)一種分散液液微萃取和氣相色譜耦合火焰電離方法檢測蜂蜜中的酚醛類抗氧化劑和BPA。研究中對影響萃取效率的主要因素，包括萃取溶劑的類型和量，以及分散溶劑的體積，鹽和pH等主要因素進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證。最佳提取條件下，檢測限和定量限分別為0.4～4.7 ng/g 和1.3～14ng/g。富集系數(shù)和提取回收率分別在144～186 和72～93%的范圍內(nèi)。方法精密度在添加濃度100 ng/g水平下的進(jìn)行評價，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為日內(nèi)7.6%（n= 6），日間8.3%（n=4）。所提出的方法已被成功地應(yīng)用到不同的蜂蜜樣品和丁基化羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚等酚醛抗氧化劑和BPA的測定。

全氟辛烷基磺酸（perfluooroctanesulfonate，PFOS）和全氟辛酸（perfluorooctanoic acid，PFOA）是在環(huán)境和食物鏈中發(fā)現(xiàn)的最顯著的全氟化合物（全氟化碳），它們被歸類為持久性和生物蓄積性的物質(zhì)。因?yàn)檫@兩種物質(zhì)在復(fù)雜的食品基質(zhì)中含量非常低，所以他們的分析檢測非常困難。Magdalena Surma等［19］開發(fā)基于分散固相萃取結(jié)合UHPLC-MS/MS方法檢測蜂蜜樣品中的PFOA和PFOS。研究中比較了不同類型的吸附劑：基于聚合物聚苯乙烯-二乙烯苯（ENV）的二氧化硅基（PSA，SAX，NH2，F(xiàn)L和C18）和乙腈作為提取溶劑。對于所有吸附劑，PFOA的回收率為40～84%，PFOS回收率為47～87%。結(jié)果表明，以聚合物ENV作為吸附劑時PFOA和PFOS獲得最佳回收率84%和87%。結(jié)果表明，固相萃取ENV吸附劑可以成功地應(yīng)用于蜂蜜中PFOA和PFOS的測定。開發(fā)方法應(yīng)用到從歐洲各個國家采集的蜂蜜樣品中，檢測到PFOA的含量范圍為0.103～0.223 ng/g，而PFOS含量低于定量限，并沒有被檢測到。

MM Gómez-Ramos等［20］使用飛行時間氣相色譜串聯(lián)高分辨率質(zhì)譜對蜂蠟中的環(huán)境污染物進(jìn)行篩選，用于非靶向環(huán)境污染物的調(diào)查以及表征蜂蠟樣品的有機(jī)污染圖案。該方法首先對目標(biāo)物進(jìn)行簡單提取，隨后用耦合飛行時間氣相色譜的高分辨率質(zhì)譜（GC-TOFMS）在電子轟擊電離（EI）模式下進(jìn)行分離檢測。進(jìn)行非靶向污染物調(diào)查的篩選方法包括通過反卷積方法對初始峰值檢測和匹配具有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的第一級質(zhì)譜EI-MS質(zhì)譜庫。為了獲得進(jìn)一步的確定污染物的結(jié)構(gòu)表征，除了代表離子的分子式，還需要至少另外兩個具有精確質(zhì)量得分的碎片離子（質(zhì)量誤差＜5ppm）。方法已經(jīng)初步用于鑒定蜂蠟中環(huán)境污染物的化學(xué)基團(tuán)，如鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）和多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）等一些常用于GC分析的污染物。

3總結(jié)

2015年已經(jīng)正式發(fā)表的有關(guān)于蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全的文獻(xiàn)主要關(guān)注點(diǎn)仍然在于農(nóng)獸藥殘和重金屬殘留分析，其主要趨勢是開發(fā)更簡單、快速、環(huán)保的前處理方法，配合高分辨檢測器實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)化合物的高通量分析，更高的靈敏度和分辨率仍然是科研工作者的不斷追求。另外，環(huán)境激素類物質(zhì)是研究蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域新的著眼點(diǎn)，已有關(guān)于鄰苯二甲酸酯、雙酚A、多環(huán)芳烴等環(huán)境污染物的相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)表。蜂產(chǎn)品中尚不能明確結(jié)構(gòu)或不能準(zhǔn)確定量的具有生物活性的物質(zhì)的分離鑒定也是科研工作者不斷探索的領(lǐng)域。

本文僅列舉了部分具有代表性的相關(guān)文獻(xiàn)，希望對今后蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全研究內(nèi)容范圍和深度有幫助。

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