cGKⅠ對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

趙　凱

(江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇　金壇　213200)

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cGKⅠ對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

趙凱

(江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇金壇213200)

〔摘要〕目的探討cGMP依賴性蛋白激酶(cGK)Ⅰ對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制。方法構(gòu)建過表達(dá)cGK Ⅰ慢病毒，感染胃癌細(xì)胞株(AGS)獲得過表達(dá)cGK Ⅰ細(xì)胞系，通過四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)測(cè)定過表達(dá)cGK對(duì)AGS細(xì)胞活力的影響，Western印跡檢測(cè)原癌基因p53，抑癌基因C-myc，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因半胱氨酸蛋白酶(caspas)3以及遷襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP-9蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果cGKⅠ腺病毒載體感染的AGS細(xì)胞，細(xì)胞活性顯著下降。p53抑癌基因和C-myc原癌基因并沒有顯著變化，細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2、7、9均顯著下降，凋亡蛋白caspase3顯著上升。結(jié)論cGKⅠ對(duì)AGS細(xì)胞增殖有抑制作用。cGKⅠ誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力的下降和凋亡的上升與抑癌基因和原癌基因無(wú)關(guān)，或者在AGS細(xì)胞中存在p53和C-myc原癌基因突變。

〔關(guān)鍵詞〕cGKⅠ；胃癌細(xì)胞

第一作者：趙凱(1974-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)鏡及消化道腫瘤的診治研究。

最近研究發(fā)現(xiàn)cGMP依賴性蛋白激酶(cGK)具有抗腫瘤作用，但其抗腫瘤的機(jī)制尚未完全闡明〔1〕?？赡艿臋C(jī)制主要有抑制營(yíng)養(yǎng)性激素及生長(zhǎng)因子的分泌、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答抑制腫瘤血管形成等〔2〕。但也有研究發(fā)現(xiàn)cGKⅠ在某些腫瘤組織中低表達(dá)〔3〕。本研究旨在初步闡明cGKⅠ在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料AGS細(xì)胞由上海生物研究所提供(cellbank)。兔抗人蛋白激酶cGKⅠ多克隆抗體購(gòu)于SANTA CRUZ，批號(hào)為SC-25429；多克隆抗體基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2(H-76)、MMP-7(FL-267)、MMP-9 (H-129)、p53(FL-393)、C-myc、半胱氨酸蛋白酶(caspase)3均購(gòu)于SANTA CRUZ公司，批號(hào)分別為sc-10736、sc-30071、 sc-10737、sc-6243、sc-789、sc-98785；腺病毒包裝試劑盒購(gòu)于invitrogen公司，pAd/CMV/V5-DESTTMGateway?Vector Kit，批號(hào)為V493-20。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人cGKⅠ腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建上游引物：5'-CGCGGATCCAGTCGGCTACTATGGCGC-3',酶切位點(diǎn)BamH1，下游引物：5'-ATCAGGCCGCGAAAGTCCTGTTATC-3'，酶切位點(diǎn)Ecor1。

從人肺動(dòng)脈組織中提取總RNA，行RT-PCR。產(chǎn)物進(jìn)行定量后，取20 μg行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)PCR產(chǎn)物后，酶切膠回收目的基因片段，多聚腺苷加尾(A-Tailing)反應(yīng)后與載體pGEM-T連接，對(duì)重組質(zhì)粒pGEM-T-cGKⅠ進(jìn)行PCR及酶切鑒定，并測(cè)序分析。純化酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶連接cGKⅠ及線性化的pAd-Track-CMV，轉(zhuǎn)化Dpα感受態(tài)細(xì)菌，篩選轉(zhuǎn)化的菌落行酶切鑒定。酶切重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV-cGKⅠ，暴露其反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(ITR)，用Lipofectamine TM 2000將線性化的pAd-CMV-cGKⅠ轉(zhuǎn)染至Ad293A細(xì)胞中，當(dāng)90%以上細(xì)胞出現(xiàn)病理征時(shí)收集細(xì)胞，反復(fù)快速凍融4次(-20℃和37℃、震蕩15 s)使細(xì)胞破裂釋放出病毒，然后將含有大量擴(kuò)增的重組腺病毒載體的上清液轉(zhuǎn)移至新Eppendorf管中。

1.2.2四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)分析將AGS細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加細(xì)胞懸液30 μl(4.8×104個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%匯合時(shí)候，換10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。按實(shí)驗(yàn)分組處理好細(xì)胞后，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入100 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育3～4 h，加120 μl二甲基亞砜(DMSO)震蕩混合15 min。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的吸光度值(OD值)。

1.2.3Western印跡將細(xì)胞密度為80%的cGKⅠ腺病毒載體轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次，裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，行電泳分離，轉(zhuǎn)膜過夜后，室溫封閉3 h。加入Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次，10 min/次。用TBST按1∶100稀釋多克隆抗體MMP-2、MMP-7、MMP-9、C-myc、p53，室溫孵育。TBST洗膜3次，10 min/次。加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，室溫孵育。蛋白檢測(cè)采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光掃描。

2結(jié)果

2.1成功構(gòu)建了cGKⅠ腺病毒表達(dá)載體擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)顯示cGKⅠ蛋白表達(dá)穩(wěn)定、高效。BamH1和EcoR1雙酶切重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-cGKⅠ，得到約9.2 kb和2.2 kb的2個(gè)片段，分別代表穿梭載體pAd-Track-CMV和cGKⅠ基因片段，證明穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖1。

圖1　pAd-Track-CMV和cGKⅠ鑒定

同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV- cGKⅠ，線性化重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV- cGKⅠ使用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞3 d后，在熒光顯微鏡下同一視野的熒光和可見光照片(CPE)上可見空斑形成，細(xì)胞變圓、腫脹、脫壁、胞核變大等病變出現(xiàn)。轉(zhuǎn)染效率為(90±5)%。pAd-CMV- cGKⅠ病毒的滴度為2×106pfu/ml。不同組梯度濃度MOI值的重組腺病毒轉(zhuǎn)染胃癌AGS細(xì)胞，免疫熒光均可測(cè)到75 kD的cGKⅠ蛋白，而空載腺病毒、陰性對(duì)照組無(wú)cGKⅠ蛋白表達(dá)，說明重組腺病毒能在胃癌AGS細(xì)胞中高效表達(dá)cGKⅠ。見圖2～圖4。

2.2Western印跡見圖5。細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2、7、9均顯著下降，凋亡蛋白caspase3顯著上升。但是，p53抑癌基因和C-myc原癌基因并沒有顯著變化，顯示cGK Ⅰ誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力的下降和凋亡的上升與抑癌基因和原癌基因無(wú)關(guān)，或者在AGS細(xì)胞中存在p53和C-myc原癌基因突變。

圖2　熒光顯微鏡下同一視野的熒光和可見光照片

圖3　pAd-CMV- cGKⅠ滴度測(cè)定

圖4　胃癌AGS細(xì)胞中高效表達(dá)cGKⅠ

圖5　Western印跡分析

2.3MTT結(jié)果cGKⅠ編碼的腺病毒載體感染AGS細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,吸光度值顯著降低，細(xì)胞活性顯著下降，細(xì)胞出現(xiàn)明顯抑制現(xiàn)象。

3討論

惡性腫瘤是危害人類健康的殺手，其中胃癌是中國(guó)常見的癌癥死亡原因之一，根據(jù)GLOBOCAN 2008的統(tǒng)計(jì)，2008年全球胃癌新發(fā)病例98.9萬(wàn)，中國(guó)為46.3萬(wàn)；同期全球死于胃癌的病例共73.7萬(wàn)，中國(guó)為35.2萬(wàn)〔4〕。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活密切相關(guān)。隨著對(duì)腫瘤分子水平認(rèn)識(shí)的不斷深入，針對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲浸潤(rùn)以及血管生成等分子靶點(diǎn)提出的分子靶向治療逐漸成為抗腫瘤藥物治療的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

關(guān)于cGKⅠ與腫瘤的關(guān)系，沒有明確的報(bào)道。最近已有越來越多的證據(jù)表明，cGKⅠ可能與細(xì)胞增殖和凋亡等活動(dòng)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。Fallahian等〔5〕的研究顯示在胸腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-468中使用cGKⅠ的特異激活劑和抑制劑控制它們的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)cGKⅠβ能夠促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。Kwon等〔6〕發(fā)現(xiàn)cGK能夠在腫瘤細(xì)胞中抑制β-catenin蛋白的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)都顯示，cGKⅠ在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。盡管有些文獻(xiàn)也指出cGKⅠ可能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的SRC活性提高其抗凋亡能力〔7〕。但這也從另一方面說明了cGKⅠ的研究?jī)r(jià)值。

caspase- 3作為調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控的重要基因，參與多種因素誘導(dǎo)的生理及病理性細(xì)胞凋亡過程〔8〕。C-myc基因在細(xì)胞的增殖與分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，C-myc基因表達(dá)的失調(diào)是多種細(xì)胞凋亡的主要誘因，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔9，10〕。抑癌基因p53在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，其中p53基因突變和p53蛋白過表達(dá)已被大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，被認(rèn)為可能成為指導(dǎo)胃癌綜合治療、判斷預(yù)后的有效指標(biāo)〔11〕。MMP具有強(qiáng)烈惡性組織特性及獨(dú)特的分解各種細(xì)胞外基質(zhì)能力，在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用〔12〕。

本文認(rèn)為cGK Ⅰ抑制胃癌細(xì)胞株AGS細(xì)胞活力，而cGK Ⅰ誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力下降和凋亡上升與抑癌基因和原癌基因無(wú)關(guān)，或者在AGS細(xì)胞中存在p53和C-myc原癌基因突變。

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〔2015-03-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目(No.JLY20120080)

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2015)22-6456-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.067