皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損中p-Akt，p-Stat3，CyclinD1的表達(dá)及意義

?

皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損中p-Akt，p-Stat3，CyclinD1的表達(dá)及意義

雷微1，陳永艷1，袁偉1，但翠娟2，李路3，沈孟奇1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義563099；2. 寧波市婦女兒童醫(yī)院 皮膚科，浙江 寧波315016;3.貴州省航天醫(yī)院 皮膚科，貴州 遵義563000)

[摘要]目的 檢測(cè)磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(p-Stat3)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)。方法 采用免疫組化SP方法檢測(cè)20例皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)和10例正常人皮膚組織中p-Akt, p-Stat3和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，利用圖像分析技術(shù)測(cè)量細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值，并分析三種蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 SCC組中p-Akt、p-Stat3和CyclinD1的平均光密度值均明顯高于正常皮膚(NOM)組(P<0.01)；p-Stat3、CyclinD1蛋白的表達(dá)與SCC不同分化程度和浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05)，p-Akt在SCC不同分化程度和浸潤(rùn)深度的組織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；p-Akt與CyclinD1的表達(dá)，p-Stat3與CyclinD1的表達(dá)及p-Stat3與p-Akt的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.551, 0.502, 0.698, P<0.05)。結(jié)論 ①SCC中存在p-Akt、p-Stat3和CyclinD1蛋白的高表達(dá)，三者可能在SCC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用；②p-Stat3在SCC中的表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的分化程度和浸潤(rùn)深度有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]皮膚鱗狀細(xì)胞癌；磷酸化蛋白激酶B；磷酸化細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3；細(xì)胞周期蛋白D1

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是導(dǎo)致細(xì)胞癌變的重要因素，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將異常生長(zhǎng)、增殖、分化信號(hào)傳至細(xì)胞而導(dǎo)致癌變。原癌基因蛋白激酶B(Protein kinase, PKB/Akt)及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducers and activators of transcription3, Stat3)，分別是PI3K/Akt和JAK/Stat3兩條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要成員，細(xì)胞周期蛋白D1(cyclicproteinD1, CyclinD1)是PI3K/Akt和JAK/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游靶基因，其異常表達(dá)可加速細(xì)胞周期循環(huán)過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)異常分化、增殖而使細(xì)胞發(fā)生癌變。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)p-Akt、p-Stat3和CyclinD1蛋白在皮膚鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma SCC)中的表達(dá)，并對(duì)這幾種蛋白的表達(dá)作相關(guān)性分析，探討其在SCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源石蠟標(biāo)本均來(lái)自我院2001～2011年皮膚科病理室經(jīng)組織病理確診的門(mén)診及住院病例。皮膚鱗狀細(xì)胞癌20例，男性10例，女性10例；年齡38～85歲，平均65.1歲；病程1月～20年，平均病程3.3年；取材部位：頭、面、四肢、軀干。根據(jù)Broders提出的病理分級(jí)法[1]將20例SCC分為：Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)7例，Ⅲ級(jí)7例；根據(jù)不同浸潤(rùn)深度分為：真皮內(nèi) 14例 皮下組織 6例；20例患者均未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。正常皮膚組織來(lái)自我院手術(shù)室外科整形手術(shù)切除多余的皮膚，其中6例男性，4例女性，年齡10～66歲，平均38歲。

1.2主要試劑p-Akt(Ser473)兔多克隆抗體和p-Stat3(Tyr705)兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，工作濃度均為1∶100。CyclinD1研究試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,工作濃度均為1∶50。

1.3免疫組化SP法切片常規(guī)脫蠟至水，抗原復(fù)性液高溫法修復(fù)抗原(p-Akt 采用微波修復(fù)；p-Stat3、CyclinD1均采用高壓修復(fù))，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水干燥、透明、中性樹(shù)膠封片。以乳腺癌石蠟切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS液代替一抗為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定由2位病理科醫(yī)生在獨(dú)立情況下對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。p-Akt為細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色和(或)棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)；p-Stat3為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色和(或)棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)；CyclinD1為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色和(或)棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張組織切片應(yīng)用Image-Pro Plus6.0彩色分析系統(tǒng)在200倍視野下隨機(jī)選取表皮中5個(gè)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域，測(cè)量細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值，取每個(gè)組織標(biāo)本的p-Akt、p-Stat3、CyclinD1蛋白的平均值作為相對(duì)量進(jìn)行定量分析。

2結(jié)果

2.1p-Akt、p-Stat3、CyclinD1的表達(dá)(見(jiàn)表1)p-Akt在SCC組中陽(yáng)性染色可見(jiàn)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿； NOM組中無(wú)p-Akt的陽(yáng)性表達(dá)(見(jiàn)圖1、2)。p-Stat3在SCC組中陽(yáng)性染色見(jiàn)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核；NOM組中呈陰性表達(dá)(見(jiàn)圖3、4)。CyclinD1在SCC組中的陽(yáng)性染色見(jiàn)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核；NOM組中疑似少量CyclinD1弱陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)于表皮基底細(xì)胞層(見(jiàn)圖5、6)。

組別例數(shù)p-Aktp-Stat3CyclinD1SCCNOM20100.118±0.0150a0.159±0.0180a0.212±0.0250.049±0.020a

aP<0.01, vs. SCC。

2.2p-Akt、p-Stat3與CyclinD1在不同分化程度及浸潤(rùn)深度組織中陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)表2，p-Stat3、CyclinD1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)在Ⅰ級(jí)與Ⅱ-Ⅲ級(jí)組中比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tp-Stat3=-3.752,tCyclinD1=-3.119,P<0.05)，而p-Akt在兩組間的陽(yáng)性表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tp-Akt=-1.138,P>0.05)。p-Stat3和CyclinD1在局限于真皮內(nèi)和浸潤(rùn)至皮下組織兩組之間的陽(yáng)性表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tp-Stat3=-2.536,tCyclinD1=

-2.456,P<0.05)，而p-Akt在不同浸潤(rùn)深度組織間的陽(yáng)性表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tp-Akt=0.610,P>0.05)。

2.3p-Akt、p-Stat3、CyclinD1三者表達(dá)的相關(guān)性p-Akt與CyclinD1在SCC中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.551,P<0.05)；p-Stat3與CyclinD1在SCC中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.502,P<0.05)；p-Stat3與p-Akt在SCC中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.698,P<0.05)。

組別例數(shù)p-Aktp-Stat3CyclinD1分化程度Ⅰ級(jí)60.091±0.0200.090±0.029a0.082±0.037aⅡ-Ⅲ級(jí)140.129±0.0200.198±0.0190.245±0.024浸潤(rùn)深度真皮內(nèi)140.125±0.0160.093±0.032b0.175±0.027b皮下組織60.101±0.0370.187±0.0190.298±0.042

與Ⅱ-Ⅲ級(jí)比較，aP<0.05 ; 與皮下組織比較，bP<0.05。

3討論

皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)是一種增殖較快，發(fā)生于表皮和(或)附屬器角朊細(xì)胞的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害，但其發(fā)病的確切分子機(jī)制并不完全清楚。大量研究表明腫瘤細(xì)胞失控性持續(xù)增殖是皮膚腫瘤同其他腫瘤一樣具有的特性，皮膚腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)異常密切相關(guān)。腫瘤的惡性行為通過(guò)觀(guān)察腫瘤細(xì)胞的分化程度來(lái)判斷，惡性程度越高，分化越低，浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移越容易，預(yù)后也越差。

Akt是一種存在于人類(lèi)染色體中的癌基因，作為磷脂酰肌醇-3羥基激酶 (PI3K)下游關(guān)鍵效應(yīng)分子，受生長(zhǎng)因子刺激后磷酸化的PI3K使Akt的構(gòu)象改變，磷酸化其重要的2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(Ser473、Thr308)，進(jìn)而通過(guò)滅活多種凋亡效應(yīng)分子、調(diào)控細(xì)胞周期、激活端粒酶活性、促進(jìn)血管生成和遷移相關(guān)程序等途徑而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲[2]。Russo AE等[3]研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤的發(fā)生機(jī)制是由于PI3K/Akt信號(hào)系統(tǒng)的Akt激活，進(jìn)而激活A(yù)kt下游的一系列靶基因，導(dǎo)致細(xì)胞分化、衰老異常、細(xì)胞異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p-Akt蛋白在SCC組織中呈高表達(dá)，與NOM組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，推測(cè)p-Akt蛋白表達(dá)水平的高低可能與SCC的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)p-Akt蛋白在SCC不同分化程度和不同浸潤(rùn)深度中陽(yáng)性表達(dá)的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這一結(jié)果與Richter P等[4]研究發(fā)現(xiàn)隨著口腔鱗癌的惡性程度的加深，p-Akt蛋白染色顯著增強(qiáng)的結(jié)果不完全一致，可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量少有關(guān)，以后我們將加大樣本量進(jìn)一步探討Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否也參與SCC的侵襲性發(fā)展。

Stat3作為Stats家族中被認(rèn)定的癌基因之一，許多研究證實(shí)在多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Stat3異常持續(xù)活化。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，Stat3主要分布于細(xì)胞漿中，當(dāng)JAK蛋白酪氨酸激酶接受細(xì)胞外信號(hào)刺激后，Stat3的酪氨酸基團(tuán)被磷酸化而激活成p-Stat3，形成的同源或異源二聚體遂轉(zhuǎn)位入核并誘導(dǎo)調(diào)控其下游與細(xì)胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的基因異常高表達(dá)進(jìn)而表現(xiàn)出致癌作用。在皮膚血管肉瘤、Kaposi's 肉瘤中均發(fā)現(xiàn)p-Stat3呈高表達(dá)狀態(tài)[5-6]。我們研究發(fā)現(xiàn)p-Stat3蛋白在SCC組織中的表達(dá)高于NOM組織，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；p-Stat3蛋白在SCC不同分化程度和浸潤(rùn)深度中陽(yáng)性表達(dá)的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這與趙洪春等[7]研究結(jié)果一致 ，提示p-Stat3蛋白的過(guò)度表達(dá)可能與SCC的發(fā)生及惡性生物行為密切相關(guān)。

CyclinD1作為細(xì)胞周期素(Cyclins)家族中重要的一員，在細(xì)胞周期進(jìn)展過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)接受細(xì)胞外信號(hào)刺激后CyclinD1呈異常表達(dá)狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞增殖周期出現(xiàn)失控，腫瘤因而發(fā)生。作為p-Stat3、p-Akt的下游靶基因，CyclinD1參與PI3K/Akt和JAK/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)腫瘤形成和發(fā)展的過(guò)程。Leslie等[8]研究提示CyclinDl mRNA和蛋白在Stat3的活化調(diào)控下呈放大狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可通過(guò)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等阻止CyclinD1降解，參與腫瘤發(fā)生[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CyclinD1蛋白在SCC組織中的的表達(dá)高于NOM組織，并且與p-Akt、p-Stat3蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，提示p-Akt、p-Stat3可能分別通過(guò)PI3K/Akt和JAK/Stat3兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)CyclinD1的過(guò)度表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，與本課題組前期在Paget病中的研究結(jié)果相一致[10]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 趙辯. 臨床皮膚病學(xué)[M].南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2010：1529.

[2] Hara S, Oya M, Mijuno R, et al. Akt activation in renal cell carcinoma: contribution of a decreased PTEN expression and the induction of apoptosis by an Akt inhibitor [J]. Ann Oncol，2005, 16(6): 928-933.

[3] Russo A E, Torrisi E, Bevelacqua Y, et a1. Melanoma: molecular pathogenesis and emerging target therapies(Review)[J]. Int J Oncol， 2009, 34(6): 148l-1489.

[4] Richter P, Bohmer F D, Hindermann W, et al. Analysis of activated EGFR signalling pathways and their relation to laminin-5 gamma2 chain expression in oral squamous cell carcinoma (OSCC)[J]. Histochemistry and Cell Biology, 2005, 124(2): 151-160.

[5] Chen S Y, Takeuchi S, Urabe K, et a1. Overexpression of phosphorylated-ATF2 and STAT3 in cutaneous angiosarcoma and pyogenic granuloma[J]. J Cutan Pathol， 2008, 35(8): 722-730.

[6] Punjabi A S, Carroll P A, Chen L. Persistent activation of STAT3 by latent kaposi's sarcoma-associated Herpesvirus infection of endothelial cells[J]. J Virol， 2007, 81(5): 2449-2458.

[7] 趙洪春, 王延飛, 何曉光. p-stat3在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與PTEN的相關(guān)性研究 [J].臨床耳鼻喉頭頸外科雜志，2013,27(18):981-985.

[8] Leslie K, Lang C, Devgan G, et al. CyclinD1 is transcriptionally regulated by and required for transformation by activated signal transducer and activator of transription3[J]. Cancer Res, 2006, 66(12): 2544-2552.

[9] Li Q, Zhu G D. Targeting serine/threonine protein kinase B/Akt and cell-cycle checkpoint kinases for treating cancer [J]. Curr Top Med Chem, 2002, 2(9): 939-971.

[10]但翠娟, 陳永艷, 袁偉, 等. Paget病皮損中p-Stat3, p-Akt, cyclinD1蛋白的表達(dá)及其相關(guān)性分析[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志, 2012, 26(7): 5-8.

[收稿2015-04-15;修回2015-05-20]

(編輯：王福軍)

臨床醫(yī)學(xué)研究

Expression of phosphorylated-Akt，phosphorylated-Stat3 and CyclinD1 in squamous cell carcinoma

LeiWei1,ChenYongyan1,YuanWei1,DanCuijuan2,LiLu3,ShenMengqi1

(1.Department of Dermatology,The Affiliate Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China;2.Department of Dermatology,Ningbo Women & Children's Hospital,Ningbo Zhejiang 315016,China;3.Department of Dermatology,Guizhou Aerospace Hospital,Zunyi Guizhou 563000,China)

[Abstract]Objective To investigate the significance of phosphorylated protein kinase B (p-Akt),phosphorylated signal transductor and activator of transcription3 (p-Stat3) and Cyclic proteinD1(CyclinD1) protein expression in the squamous cell carcinoma(SCC).Methods The expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 were detected by Immunohistochemistry in 20 cases of SCC and 10 cases of normal human skin tissues. The positive protein expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 were measured and quantified by Image analysis and the mean optical density was determined. These protein expressions and their relationship with the pathological factors were analyzed.Results The mean optical density of p-Akt, p-Stats3 and CyclinD1 protein were obviously higher in SCC group than those in normal skin (NOM) group (P<0.01).The expressions of p-Stat3 and CyclinD1 protein were correlated with the tumor differentiation degree and the depth of tumor invasion in SCC (P<0.05), but the expression of p-Akt didn’t differ (P>0.05). In SCC, positive correlation between expressions of p-Stat3 and CyclinD1, p-Akt and CyclinD1, p-Stat3 and p-Akt (r were 0.551, 0.502 and 0.698 respectively, P<0.05) were found.Conclusion 1)There were high-expressions of p-Akt, p-Stat3 and CyclinD1 in SCC, which may play an important role in the development of SCC. 2) The expression intensity of p-Stat3 was correlated with both the tumor differentiation degree and the depth of tumor invasion in SCC.

[Key words]squamous cell carcinoma; phosphorylated-Akt; phosphorylated-Stat3; CyclinD1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中圖法分類(lèi)號(hào)] R739.5 A

[文章編號(hào)]1000-2715(2015)03-0275-04

[基金項(xiàng)目]貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(NO:gzwkj2008-1-027)。

[通信作者]陳永艷，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：皮膚分子生物學(xué)，E-mail:cyyzy@126.com。