青蒿內(nèi)生真菌IS928產(chǎn)青蒿素類化合物的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

周小林， 厲大偉， 周依婷， 鄧元元， 蘭時(shí)樂(lè)　(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

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青蒿內(nèi)生真菌IS928產(chǎn)青蒿素類化合物的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

周小林， 厲大偉， 周依婷， 鄧元元， 蘭時(shí)樂(lè)*(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

植物內(nèi)生菌是指在植物生活史的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)部而不引起植物明顯病害癥狀的菌[1]，屬于植物組織內(nèi)的正常菌群，包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。自短葉紅豆杉中分離到產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌以來(lái)[2]，許多研究工作者從長(zhǎng)春花[3]、美登木[4]、黃花夾竹桃[5]、薯預(yù)[6]、連翹[7]、喜樹[8-9]、虎杖[10]、杜仲[11]等植物中分離到能產(chǎn)生與宿主相同或相似的化學(xué)成分的內(nèi)生真菌，表明植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生功能特殊的次生代謝產(chǎn)物，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、工業(yè)、食品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[12]。目前，植物內(nèi)生真菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌的分離、活性成分鑒定等方面，而對(duì)植物內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件的研究報(bào)道較少[13-15]。筆者從健康的青蒿莖稈中分離到一株能產(chǎn)青蒿素類化合物的米曲霉IS928。該菌青蒿素類化合物產(chǎn)量較低，為進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)和活性物質(zhì)的分離、純化帶來(lái)困難。筆者研究了包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等對(duì)菌株積累青蒿素類化合物的影響，并且采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成進(jìn)行優(yōu)化，以期為該菌株規(guī)模化生產(chǎn)青蒿素類化合物提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。產(chǎn)青蒿素類化合物菌種IS928是從野生青蒿中分離出的內(nèi)生菌。經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)初步鑒定為米曲霉，被保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物研究室。

1.1.2培養(yǎng)基配方。斜面培養(yǎng)基(PDA)組成為：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15~20 g，蒸餾水1 000 ml,pH自然;液體種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2%，豆餅粉1.5%，玉米粉2%，MgSO4·7H2O 0.1%,CaCO30.3%，(NH4)2SO41%，KH2PO40.2%，pH自然；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2%，豆餅粉2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，NaCl 0.05%，pH自然。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)。

1.2.1.1斜面菌種培養(yǎng)。將保存于4 ℃冰箱中的米曲霉IS928接種于新鮮的PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)至成熟，備用。

1.2.1.2液體種子液培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)成熟的斜面種子，接種于裝有100 ml液體種子培養(yǎng)基的250 ml的三角瓶中，30 ℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)2 d，備用。

1.2.1.3發(fā)酵培養(yǎng)。按10%(V/V)接種量，將培養(yǎng)好的液體種子，接種于裝有100 ml發(fā)酵養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，30 ℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d,3次重復(fù)。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基配方的篩選。采用單因素試驗(yàn)法，分別改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源種類和添加量、氮源種類和添加量、KH2PO4及MgSO4·7H2O添加量，其他條件不變，考察其對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。利用Design-Expert8.0.5b軟件，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量影響較大的因素如蔗糖、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O等作為考察對(duì)象，以青蒿素類化合物產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面四因素三水平進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平及編碼見(jiàn)表1。

1.3測(cè)定

1.3.1菌絲體收集。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，傾去上清液后用適量蒸餾水重懸，將菌絲體懸浮液傾倒于20目的篩網(wǎng)上，并且用蒸餾水反復(fù)沖洗，直至將培養(yǎng)基殘?jiān)磧?，收集菌絲體，于50 ℃下干燥后稱重且粉碎。備用。

1.3.2青蒿素類化合物提取。準(zhǔn)確稱取4.000 g粉碎后的菌絲體，加入100 ml濃度95%的乙醇，超聲波處理15 min，抽濾，濾渣重復(fù)上述步驟，合并濾液，在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50 ℃下濃縮得浸膏，加入適量無(wú)水乙醇溶解，倒入50 ml容量瓶中且定容。

表1　設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼　%

1.3.3測(cè)定。青蒿素類化合物的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[16]提供的方法進(jìn)行。取青蒿素類化合物溶液4、16 ml濃度0.2%NaOH，在50 ℃恒溫水浴箱中反應(yīng)30 min，過(guò)濾后在292 nm處測(cè)定OD值。根據(jù)青蒿素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每100 ml發(fā)酵液中青蒿素類化合物的產(chǎn)量。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1碳源種類對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，分別加入4%的麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、乳糖，其他條件不變，分別測(cè)定不同碳源對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。從圖1可以看出，以蔗糖為碳時(shí)青蒿素類化合物產(chǎn)量最大，達(dá)10.48 mg/L。

2.1.2蔗糖添加量對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。改變發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖的含量，分別加入2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%的蔗糖，其他條件不變，考察蔗糖不同添加量對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。從圖2可以看出，在一定蔗糖添加量范圍內(nèi)，青蒿素類化合物的產(chǎn)量隨蔗糖添加量的增加而增加，當(dāng)蔗糖添加量為3%時(shí)，青蒿素類化合物產(chǎn)量最高。但是，當(dāng)蔗糖添加量超過(guò)3%時(shí)，青蒿素類化合物產(chǎn)量明顯下降。主要原因?yàn)榧哟笳崽堑奶砑恿浚淖兓A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮比，影響菌絲的生長(zhǎng)速度和青蒿素類化合物產(chǎn)量的積累。

2.1.3氮源種類對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。在等氮條件下，改變培養(yǎng)基中氮源種類，分別加入豆餅粉、魚粉、酵母粉、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨，其他條件不變，分別考察氮源種類對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。從圖3可以看出，不同的氮源對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響較大。當(dāng)以酵母粉為氮源時(shí)，青蒿素類化合物產(chǎn)量最高。同時(shí)，無(wú)機(jī)氮源不適合該菌積累青蒿素類化合物。

2.1.4酵母粉添加量對(duì)青蒿素產(chǎn)量的影響。改變酵母粉的添加量，分別在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量百分比的酵母粉(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)，其他條件不變，測(cè)定青蒿素類化合物的產(chǎn)量。從圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，青蒿素類化合物產(chǎn)量隨著酵母粉添加量的增加而增加。當(dāng)酵母粉添加量為2.5%時(shí)，青蒿素類化合物產(chǎn)量最高，但當(dāng)酵母粉添加量超過(guò)2.5%時(shí)青蒿素類化合物產(chǎn)量下降。

2.1.5KH2PO4添加量對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的KH2PO4，其他條件不變，分別考察不同KH2PO4添加量對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。從圖5可以看出，青蒿素類化合物產(chǎn)量隨KH2PO4添加量的增加而增加，當(dāng)KH2PO4添加量為0.3%時(shí)青蒿素類化合物產(chǎn)量達(dá)到15.83 mg/L。

2.1.6MgSO4·7H2O添加量對(duì)青蒿素類化合物的影響。分別改變培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的添加量(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)，其他條件不變，考察MgSO4·7H2O添加量對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響。從圖6可以看出，當(dāng)MgSO4·7H2O含量為0.2%時(shí)，青蒿素類化合物的產(chǎn)量最大。

2.2培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.2.1青蒿素類化合物產(chǎn)量的方差分析。根據(jù)表2試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert8.0.5b軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由表3可知，A2、B2、C2、D2對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的影響極顯著(P<0.000 1)，說(shuō)明蔗糖、酵母粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O添加量是青蒿素類化合物合成過(guò)程中的重要因素，但只有AB的交互作用較顯著(P< 0.05)。該模型極顯著，且失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明數(shù)據(jù)中無(wú)異常點(diǎn)，模型適當(dāng)。

表2　Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表3　響應(yīng)面結(jié)果方差分析

注：*、**分別表示差異在0.05、0.01水平差異。

2.2.2模型的可信度分析。經(jīng)方差分析，回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)為0.926 4，說(shuō)明92.64%的青蒿素類化合物產(chǎn)量變化可由該模型解釋；校正相關(guān)系數(shù)為0.840 6，變異系數(shù)為2.88%，信噪比為12.438，說(shuō)明模型的可信度較高。因此，可采用上述模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

根據(jù)響應(yīng)面系數(shù)的回歸分析，得到該次模型的擬合方程為：

R=1 744.579 0+17.615 9A-26.394 7B-4.084 7C-19.424 6D-55.935 9AB+39.339 9AC+35.092 1AD+7.911 9BC-17.312 1BD-4.278 2CD-164.342 2A2-168.912 2B2-125.065 2C2-113.075 3D2

對(duì)擬合方程自變量求一階偏導(dǎo)等于0，求解得到青蒿素類化合物產(chǎn)量最大值所對(duì)應(yīng)的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：蔗糖3.15%、酵母粉2.27%、KH2PO40.254%、MgSO4·7H2O 0.173%，得到預(yù)測(cè)青蒿素類化合物產(chǎn)量最大值(17.44 mg/L)。

2.2.3響應(yīng)面分析。采用Design-Expert 8.0.5b軟件，對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的回歸模型進(jìn)行分析。等高線的形狀可以反映出各因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，即圓形表示兩因素不顯著，而橢圓則表示較為顯著[17]。從圖7~12可以看出，各響應(yīng)面圖都存在極值，蔗糖和酵母粉添加量、蔗糖和KH2PO4添加量、KH2PO4和MgSO4·7H2O添加量、蔗糖和MgSO4·7H2O添加量對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量存在較顯著的交互作用，而酵母粉和MgSO4·7H2O添加量、酵母粉和KH2PO4添加量對(duì)青蒿素類化合物產(chǎn)量的交互作用不顯著。

2.2.4模型驗(yàn)證。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到各因素的優(yōu)化值，即在蔗糖3.15%、酵母粉2.27%、KH2PO40.254%、MgSO4·7H2O0.173%條件下進(jìn)行青蒿內(nèi)生菌產(chǎn)青蒿素類化合物發(fā)酵試驗(yàn)，重復(fù)3次，測(cè)得青蒿素類化合物平均產(chǎn)量17.19 mg/L。這與理論預(yù)測(cè)值17.44 mg/L接近，相對(duì)誤差為1.420 9%，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)青蒿素類化合物的實(shí)際產(chǎn)量情況。

3結(jié)論與討論

微生物的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量高低除了由菌種自身的遺傳性狀決定外，還與微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組成、環(huán)境條件密切相關(guān)。目前，通過(guò)微生物生產(chǎn)活性成分主要有固體發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法，其中液體深層發(fā)酵法具有發(fā)酵周期短、易于控制和生物活性成分提取效率高等特點(diǎn)，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。利用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)生物活性物質(zhì)，曾茜等[18]對(duì)蒿屬植物內(nèi)生菌(Penicilliumsp.)產(chǎn)抗癌活性產(chǎn)物的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化；王曦等[19]采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化雙氫青蒿素生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基，獲得9-羥基雙氫青蒿素得率較優(yōu)化前提高73.30%的理想結(jié)果；楊磊等[20]從云南紅豆杉樹皮中分離到一株產(chǎn)巴卡亭Ⅲ的曲霉屬內(nèi)生真菌，并且對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，巴卡亭Ⅲ的產(chǎn)量達(dá)34.6 μg/L；高楊[21]采用復(fù)合誘變產(chǎn)小檗堿內(nèi)生真菌獲得高產(chǎn)菌株S-NU-3-2，并且優(yōu)化其發(fā)酵條件，小檗堿產(chǎn)量提高了47.2%。筆者從青蒿莖稈中分離到一株能產(chǎn)青蒿素類化合物的米曲霉IS928。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化該菌株液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成，獲得適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，為蔗糖3.15%、酵母粉2.47%、KH2PO40.291%、MgSO4·7H2O0.193%、NaCl 0.05%，得到青蒿素類化合物產(chǎn)量平均值為17.19 mg/L。

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摘要[目的] 為了開發(fā)青蒿素類化合物新的生產(chǎn)方法。[方法] 從青蒿中分離出一株產(chǎn)青蒿素類化合物的內(nèi)生真菌IS928，采用單因素試驗(yàn)法研究了液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)青蒿素類化合物合適的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等對(duì)其產(chǎn)量的影響，并采用響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。[結(jié)果] 適宜培養(yǎng)基配方為：蔗糖3.15%，酵母粉2.27%，KH2PO40.254%，MgSO4·7H2O0.173%，NaCl0.05%，得到青蒿素類化合物產(chǎn)量平均值為17.19 mg/L。[結(jié)論] 該研究為青蒿素類化合物發(fā)酵生產(chǎn)的研究提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞內(nèi)生真菌；青蒿素類化合物；響應(yīng)面分析法；發(fā)酵；優(yōu)化

Optimization of Fermentational Medium for Endophatic Fungus Producing Artemisinin Derivatives,Artemisiacarvifolia

ZHOU Xiao-lin, LI Da-wei, ZHOU Yi-ting, LAN Shi-le*et al(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128)

Abstract[Objective] The research aimed to develop the new production method of Artemisinin derivatives.[Method] A endophytic fungus IS928 producing artemisinin derivatives were isolated from Artemisia carvifolia. The effects of optimal medium composition for the production artemisinin derivatives in liquid-state fermentation including carbon sources, nitrogen sources and inorganic salt were studied by using single-factor experiment and the optimal fermentation medium was optimized by using response surface method.[Result] The optimal fermentation medium composition were as follows: sucrose 3.15%, yeast powder 2.27%, MgSO4·7H2O 0.173%, KH2PO40.254%, NaCl 0.05%. Under these conditions, the production of artemisinin derivatives reached 17.19 mg/L.[Conclusion] This study can provide a theoretical basis in fermentation production of Artemisinin derivatives.

Key wordsEndophytic fungus; Artemisinin derivatives; Response surface methodology; Fermantation; Optimization

收稿日期2015-10-12

通訊作者

作者簡(jiǎn)介周小林(1977-)，男，湖南新化人，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)。*，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事微生物資源與利用方面的研究。

中圖分類號(hào)S 188+.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)32-038-06