miR-215對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制

林振呂　張　琳　鄭建濤

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診外科，福建　福州　350005)

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miR-215對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制

林振呂張琳鄭建濤1

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診外科，福建福州350005)

摘要〔〕目的探討miR-215對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及作用機(jī)制。方法通過(guò)RT-PCR檢測(cè)miR-215在高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞株NCI-N87，BGC-823，RF-48及低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HGC-27及MKN-28中的表達(dá)；Transwell遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-215抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響；Western印跡檢測(cè)miR-215抑制劑對(duì)胃癌細(xì)胞活化白細(xì)胞黏附分子(ALCAM)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2，MMP-9，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白E-鈣黏附素(E-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)表達(dá)量的影響。結(jié)果RT-PCR結(jié)果證實(shí)miR-215在高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)高于低轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，且miR-215在BGC-823細(xì)胞中的表達(dá)最高，因此選用BGC-823作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。miR-215抑制劑轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞48 h后，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-215表達(dá)能顯著抑制BGC-823細(xì)胞遷移及侵襲能力，并能下調(diào)ALCAM，MMP-2，MMP-9及Vimentin表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)。結(jié)論miR-215低表達(dá)能顯著抑制胃癌細(xì)胞BGC-823侵襲及轉(zhuǎn)移能力，與下調(diào)MMPs及抑制EMT生成有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕miR-215；胃癌細(xì)胞；侵襲；轉(zhuǎn)移

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科

第一作者：林振呂(1968-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事普外科研究。

隨著外科手術(shù)水平，生物治療及化療放療手段的提高，胃癌患者的治愈率大大提高，但是5年生存率不足30%，主要原因是腫瘤組織的侵襲轉(zhuǎn)移導(dǎo)致預(yù)后不良〔1,2〕。同時(shí)胃癌早期癥狀不易發(fā)現(xiàn)或無(wú)任何癥狀，因此，常導(dǎo)致診斷被延誤。所以探索高敏感性，高特異性的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于胃癌的診斷及腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究具有重要意義。大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，miRNA與腫瘤的增殖，凋亡，分化，侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在人類腫瘤包括胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用〔3,4〕。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)miR-215在胃癌組織中表達(dá)異常，如Jin等〔5〕通過(guò)miRNA芯片技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量-PCR證實(shí)miR-215在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，且過(guò)表達(dá)miR-215可顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞HFE145遷移。李良平等〔6〕發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中miR-215的含量高于健康對(duì)照者，提示miR-215的表達(dá)與胃癌的發(fā)生或發(fā)展有關(guān)。因此本文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討miR-215在不同轉(zhuǎn)移程度胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，從中選出miR-215表達(dá)量最高的胃癌細(xì)胞株，并探討miR-215對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機(jī)制。

1材料和方法

1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株NCI-N87，BGC-823，HGC-27購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)分別為：TCHu130，TCHu11，TCHu22；RF-48，MKN-28購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司；分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。

1.2試劑及儀器四唑鹽試劑(MTT，Sigma公司)；兔抗基質(zhì)金屬蛋白(MMP)-2，MMP-9，E-鈣黏附素(E-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)， 活化白細(xì)胞黏附分子(ALCAM)，GADPH抗體(Epitmics公司)；Transwell 小室(Corning 公司)；結(jié)晶紫(Sigma公司)；miR-215抑制劑，miR-215 NC(上海吉瑪制藥公司)。倒置顯微鏡(Nikon公司)；流式細(xì)胞儀(BD 公司)；迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.3RT-PCR檢測(cè)miR-215在胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)總RNA的提取參考Trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說(shuō)明書，整個(gè)提取處于無(wú)RNAase的環(huán)境下。引物設(shè)計(jì)如下，miR-215上游引物：5'-CTCGAGATGTCATCCTCAG-3'，下游引物：5'GAATTCGTGAGTTCTTCTG-3'。 GAPDH作為內(nèi)參標(biāo)記物，上游引物：5'- AATCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游引物5'- CCTGCTTCAACCACCTTCTTG-3'。通過(guò)一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取 5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測(cè)。

1.4遷移實(shí)驗(yàn)將BGC-823接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-215抑制劑和對(duì)照NC，轉(zhuǎn)染達(dá)到48 h后，將細(xì)胞消化加入Transwell上室，下室用含 5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，洗滌，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，被染色的細(xì)胞漿呈紫色，倒置光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，即表示細(xì)胞的遷移能力。

1.5侵襲實(shí)驗(yàn)將 Matrigel 膠均勻平鋪于Transwell 小室的微膜(8 μm)上，制成凝膠備用。后按1.4方法進(jìn)行操作，最后倒置光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，即表示細(xì)胞的侵襲能力。

1.6Western印跡當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，轉(zhuǎn)miR-215和對(duì)應(yīng)的對(duì)照NC，轉(zhuǎn)染達(dá)到48 h后，轉(zhuǎn)染達(dá)到48 h后，刮下細(xì)胞，離心，后加入適量的RIPA裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中震蕩30 s，40 min后，4℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4℃過(guò)夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.7數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1miR-215在5株胃癌癌細(xì)胞株中的表達(dá)通過(guò)RT-PCR和檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-215在RF-48、NCI-N87、BGC-823高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)量〔(2.30±0.22)，(2.54±0.14)，(3.22±0.25)〕高于MKN-28、HGC-27低轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)量〔(1.01±0.21)、(1.31±0.20)〕，且在BGC-823中miR-215表達(dá)量最高，因此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。

2.2miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響如圖1，圖2所示，抑制劑及NC轉(zhuǎn)染48 h后，與NC組比較，miR-215抑制劑能顯著抑制BGC-823細(xì)胞遷移能力〔(99.05%±7.43%)vs(48.32%±5.38%)〕及侵襲能力〔(99.98%±8.12%)vs(55.45%±6.07%)〕(P<0.01)。

圖1　miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞遷移能力的影響

圖2　miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響

2.3miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞中ALCAM表達(dá)量的影響如圖3所示，與NC組(1.25±0.14)比較，miR-215抑制劑(0.34±0.05)能顯著抑制BGC-823細(xì)胞中ALCAM的表達(dá)(P<0.01)。

圖3　miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞中ALCAM表達(dá)量的影響

2.4miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞中MMPs表達(dá)量的影響如圖4，表1所示，與NC組比較，miR-215抑制劑能顯著抑制BGC-823細(xì)胞中MMP-2及MMP-9的表達(dá)(P<0.01)。

圖4　miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞中MMPs表達(dá)量的影響

2.5miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞中E-cadherin及Vimentin表達(dá)量的影響如圖5及表1示，與NC組比較，miR-215抑制劑能顯著抑制BGC-823細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)(P<0.01)。

圖5　miR-215抑制劑對(duì)BGC-823細(xì)胞中E-cadherin及Vimentin表達(dá)量的影響

組別MMP2/GADPHMMP9/GADPHE-cadherinGADPHVimentin/GADPHNC組1.29±0.140.88±0.080.37±0.041.05±0.10miR-215抑制劑組0.33±0.011)0.42±0.041)0.99±0.081)0.32±0.031)

與NC組比較：1)P<0.01

3討論

miRNAs是一類進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，由21～23個(gè)氨基酸組成，它能夠結(jié)合于靶基因mRNA的3'-UTR區(qū)域，阻遏靶基因的翻譯，從而調(diào)控靶基因表達(dá)，參與多種疾病的病理生理過(guò)程。miR-215定位于人染色體1q41，在胃癌組織或血清中高表達(dá)，并通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平影響胃癌細(xì)胞的增殖遷移能力〔5〕。因此本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)miR-215在不同轉(zhuǎn)移程度胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移胃癌細(xì)胞株中miR-215的表達(dá)高于低轉(zhuǎn)移程度胃癌細(xì)胞株，且下調(diào)miR-215能顯著的抑制BGC-823細(xì)胞的遷移侵襲能力，但具體機(jī)制未知。而先前Jin等〔5〕，周志威等〔7〕的研究報(bào)道證實(shí)ALCAM是miR-215的靶分子之一，且ALCAM在胃癌組織中表達(dá)異常。ALCAM是一種廣泛存在于人體各組織器官中的糖蛋白，能通過(guò)介導(dǎo)同嗜性黏附或異嗜性作用介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附，從而影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增加可顯著促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。因此，通過(guò)下調(diào)ALCAM的表達(dá)量能一定程度上的抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。

同時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的必要步驟，MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的最重要的蛋白水解酶，在細(xì)胞腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMP-2不僅可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的明膠Ⅳ型膠原等，有利于腫瘤細(xì)胞沿著受損的基底膜向周圍浸潤(rùn)，還可以通過(guò)新生毛細(xì)血管促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，是惡性腫瘤浸潤(rùn)和侵襲的標(biāo)志〔8〕。MMP-9是由多種細(xì)胞分泌的一種蛋白水解酶，是MMPs中分子量最大的酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，從而增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。MMPs在腫瘤細(xì)胞的侵襲過(guò)程中起到至關(guān)重要的影響。陳進(jìn)等〔9〕發(fā)現(xiàn)MMP-2在胃癌組織中的表達(dá)率為75%，MMP-9在胃癌組織中的表達(dá)率為68.3%，均顯著高于周圍正常組織。孫述臣等〔10〕通過(guò)Northern印跡原位分子雜交ISH法證實(shí)胃癌組織中MMP2及MMP-9 mRNA的表達(dá)水平高于正常組織。臨床研究Meta分析也指出，MMP-9的高表達(dá)能夠增加胃癌組織的侵襲性，影響胃癌患者的預(yù)后〔11〕。因此通過(guò)下調(diào)胃癌細(xì)胞中MMPs的表達(dá)，能顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲能力。

上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)最早在胚胎發(fā)育過(guò)程中得到證實(shí)，越來(lái)越多的證據(jù)表明EMT對(duì)腫瘤發(fā)生，包括局部浸潤(rùn)和通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散起著重要作用，是侵襲能力最強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞的特性，并且在惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，可視為浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的開始〔12,13〕。EMT的分子標(biāo)志性特征為細(xì)胞間黏附分子E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，一系列間充質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)上調(diào)，包括N-cadherin，Vimentin和纖連蛋白。李德艷等〔14〕發(fā)現(xiàn)胃癌組織中E-cadherin表達(dá)陽(yáng)性率為33.33%，明顯低于正常胃癌組織。熊德明等〔15〕證實(shí)Vimentin在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與了EMT，在胃癌轉(zhuǎn)移過(guò)程起重要作用。因此通過(guò)抑制EMT的生成，也能顯著的抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

本研究說(shuō)明miR-215抑制劑可通過(guò)下調(diào)ALCAM及MMPs表達(dá)來(lái)抑制BGC-823細(xì)胞的遷移侵襲能力，顯著抑制EMT的生成，與上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Vimentin表達(dá)有關(guān)。

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〔2014-05-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

通訊作者：鄭建濤(1967-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸癌診治及基礎(chǔ)研究。

中圖分類號(hào)〔〕R73〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6064-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.026