水溶性殼聚糖對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌的作用

張二偉　馬佳男　費(fèi)　瑜　?！〈洹∪螐╀h

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，吉林　長(zhǎng)春　130041)

?

水溶性殼聚糖對(duì)缺血再灌注損傷大鼠心肌的作用

張二偉馬佳男1費(fèi)瑜桑翠任彥鋒2

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，吉林長(zhǎng)春130041)

摘要〔〕目的探討水溶性殼聚糖(WSC)對(duì)心肌缺血再灌注損傷(IRI)大鼠心肌的作用機(jī)制。方法將60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IRI模型組、低劑量WSC組、中劑量WSC組、高劑量WSC組，每組 12只。其中，IRI模型組和各劑量WSC組大鼠用結(jié)扎左冠脈前室間支法建立大鼠IRI模型，假手術(shù)組大鼠僅分離而不結(jié)扎左冠脈前室間支。假手術(shù)組和IRI模型組給予生理鹽水10 ml/kg、低、中、高劑量WSC組分別給予120、180 mg/kg和240 mg/kg，灌胃1次/d，15 d后處死大鼠，心臟取血，分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附(ELSIA)法檢測(cè)血清中起氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平，用酶動(dòng)力法檢測(cè)肌酸激酶(CK)和低密度脂蛋白(LDH)水平。在靠近心尖部1/3處平行于房室溝橫行切取心肌組織塊，固定后石蠟包埋。用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察心肌組織形態(tài)變化。結(jié)果光鏡下觀察，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核染色清晰，心肌間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；IRI模型組大鼠心肌纖維紊亂，界限不清，胞質(zhì)淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死；WSC干預(yù)組肌纖維偶有斷裂、融解現(xiàn)象，少量心肌細(xì)胞顆粒變性、水腫，偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與假手術(shù)組相比，IRI模型組SOD水平明顯下降，而CK、LDH、 MDA、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與IRI模型組比較，低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組可顯著提高SOD水平，降低CK、LDH、 MDA、IL-6和TNF-α水平(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論WSC逆轉(zhuǎn)心肌IRI，對(duì)IRI大鼠心肌具有保護(hù)作用。這種作用可能與對(duì)抗IRI時(shí)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕超氧化物歧化酶；丙二醛；白細(xì)胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

1吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院2新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心內(nèi)科

第一作者：張二偉(1991-)，男，在讀碩士，主要從事心血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

心肌缺血再灌注損傷(IRI)的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有極其密切的關(guān)系，藥物可通過對(duì)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來防止心肌IRI〔1～3〕。水溶性殼聚糖(WSC)是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，具有抗氧化和抗炎等方面作用〔4～7〕。但目前有關(guān)WSC能否防治心肌IRI的文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本文制作大鼠心肌IRI模型，并用WSC進(jìn)行干預(yù)，旨在探討WSC對(duì)IRI大鼠心肌的作用及其機(jī)制，為藥物防治心肌IRI提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料健康雄性清潔級(jí)SD大鼠，吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供〔動(dòng)物合作證號(hào)SCXX(吉)2010-0005〕，體重(250±10)g。飼養(yǎng)條件：室溫18℃～25℃，相對(duì)濕度 40%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水，所有大鼠實(shí)驗(yàn)前在室內(nèi)給予標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)飼養(yǎng)2 d，實(shí)驗(yàn)前稱重，禁食12 h。

UltraCutE 超薄切片機(jī)(奧地利衛(wèi)永儀器公司)，顯微鏡(日本JEOL公司)，酶標(biāo)測(cè)定儀(日本 MODEL550)，小動(dòng)物人工呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日立)WSC(青島海普生物技術(shù)有限公司，溶解度為125，脫乙酰度54.73%)，大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法按文獻(xiàn)報(bào)道方法建模：麻醉，仰臥固定手術(shù)臺(tái)上，連接小動(dòng)物人工呼吸機(jī)和心電圖機(jī)。剪開心包膜，暴露心臟，左手拇食指輕壓胸廓把心臟擠出，于左心耳下方2 mm處，用10/0號(hào)無損傷縫合針穿線，進(jìn)針深度為1.5～2 mm，寬為2～3 mm，適應(yīng)5 min，在縫合線與左冠脈前室間支血管間墊于一細(xì)小塑料管(直徑約1.0 mm)，結(jié)扎時(shí)用活結(jié)結(jié)扎。同步觀察心電圖變化，當(dāng)出現(xiàn)ST段抬高與高聳T波融合呈弓背向上單向曲線為左室游離壁缺血成功的標(biāo)志。結(jié)扎30 min后剪去膠管使缺血再灌通，再灌通時(shí)間為120 min。再通后心電圖形表現(xiàn)為缺血圖形減輕或出現(xiàn)病理性Q波，當(dāng)抬高的ST段下降1/2以上者，以此圖形作為心肌IRI標(biāo)準(zhǔn)，符合標(biāo)準(zhǔn)者即為心肌IRI造模成功并入選實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組僅分離左冠脈前室間支，并穿線不結(jié)扎。

將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IRI模型組、低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組，每組12只。假手術(shù)組和IRI模型組分別給予生理鹽水10 ml/kg、低、中、高劑量WSC組分別給予120、180 mg/kg和240 mg/kg，灌胃1次/d，連續(xù)15 d。各組分別于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠，心臟取血，分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附(ELSIA)法檢測(cè)血清中SOD、MDA 、TNF-α和IL-6水平。用酶動(dòng)力法檢測(cè)肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)水平。在靠近心尖部1/3處平行于房室溝橫行切取心肌組織塊，放入4% 多聚甲醛溶液，固定24 h，石蠟包埋。用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察心肌組織形態(tài)變化。

2結(jié)果

2.1大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察光鏡下觀察，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞核染色清晰，心肌間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；IRI模型組大鼠心肌纖維紊亂，界限不清，胞質(zhì)淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死；WSC干預(yù)組肌纖維偶有斷裂、融解現(xiàn)象，少量心肌細(xì)胞顆粒變性、水腫，偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

圖1　大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化(HE，10×40)

2.2WSC對(duì)IRI大鼠血清CK和LDH水平的影響與假手術(shù)組〔(887.24±156.32)U/L〕相比，IRI模型組CK的水平〔(2 023.57±861.71)U/L〕明顯升高(P<0.01)；與IRI模型組比較，低劑量WSC組〔(1 514.23±716.38)U/L〕、中劑量WSC組〔(1 492.91±544.25)U/L〕和高劑量WSC組〔(1 134.52±479.28)U/L〕的CK水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。與假手術(shù)組〔(799.84±98.54)U/L〕相比，IRI模型組LDH的水平〔(1 763.55±162.15)U/L〕明顯升高(P<0.01)；與IRI模型組比較，低劑量WSC組〔(1 287.29±136.32)U/L〕、中劑量WSC組〔(1 195.96±125.17)U/L〕和高劑量WSC組〔(1 012.17±101.25)U/L〕的LDH水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

2.3WSC對(duì)IRI大鼠血清SOD、MDA、IL-6和TNF-α水平的影響，與假手術(shù)組相比，IRI模型組SOD水平下降，而MDA、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與IRI模型組比較，低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組可顯著提高SOD水平，降低MDA、IL-6和TNF-α水平(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1　WSC對(duì)IRI大鼠血清SOD、MDA、IL-6和

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與IRI模型組比較：2)P<0.05；3)P<0.01

3討論

在生理狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)的活性氧簇對(duì)機(jī)體有一定的保護(hù)作用，當(dāng)較多的活性氧簇產(chǎn)生后，機(jī)體多數(shù)組織器官可通過抗氧化系統(tǒng)清除活性氧簇，使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能維持在穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。SOD是機(jī)體內(nèi)清除活性氧簇的一種金屬酶，能使生物體內(nèi)過氧化物轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧，其活性的高低可間接反映體內(nèi)自由基的濃度。MDA是膜脂質(zhì)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，是反映氧化損傷的指標(biāo)。已有報(bào)道，IRI時(shí)大鼠心肌纖維紊亂，界限不清，胞質(zhì)淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死，血清 SOD水平明顯下降、CK、LDH、MDA水平明顯升高〔1，2〕，提示SOD和MDA與心肌IRI有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)氧化應(yīng)激參與心肌IRI病理過程的結(jié)論。IRI時(shí)由于黃嘌呤氧化酶形成增多、中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)等原因使得活性氧簇增多，這些過多活性氧簇本應(yīng)由機(jī)體清除，但由于此時(shí)SOD的能力下降，結(jié)果導(dǎo)致活性氧簇大量堆積，造成機(jī)體進(jìn)一步損傷。因此SOD活性降低是導(dǎo)致心肌IRI的主要原因。

IRI時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧簇可從以下幾方面對(duì)機(jī)體損傷：(1)破壞生物膜的結(jié)構(gòu)，使不飽和脂肪酸與蛋白質(zhì)比例失調(diào)，細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的液態(tài)性及流動(dòng)性降低，進(jìn)而導(dǎo)致通透性增加，鈣離子內(nèi)流增加。另外，還能間接地抑制膜蛋白功能，進(jìn)而影響離子通道的正常功能。上述變化引起膜電位不穩(wěn)定，觸發(fā)嚴(yán)重的心律失常；(2)使細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和酶氧化，使其功能下降；(3)使細(xì)胞內(nèi)DNA斷裂，染色體變異；(4)激活血小板環(huán)氧化酶，生成TXA2，促進(jìn)血栓形成；(5)線粒體膜損傷，使其功能障礙，ATP合成減少。

再灌注時(shí)的炎癥反應(yīng)貫穿于IRI的全過程，促進(jìn)了心肌繼發(fā)性損害，是心肌IRI的主要原因之一。IL-6、TNF-α是重要的炎癥遞質(zhì)，它們主要是由單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有吸引和激活上述細(xì)胞，可誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)。鐘偉等〔3〕對(duì)IRI大鼠的炎癥因子進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)IRI時(shí)炎癥因子升高；孫莉等〔2〕發(fā)現(xiàn)IRI時(shí)炎癥因子變化與心室功能和心肌損傷程度相平行。本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，證實(shí)心肌缺血再灌注給機(jī)體造成損傷，這一過程與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

IRI時(shí)體內(nèi)TNF-α和IL-6可從以下幾方面對(duì)機(jī)體損傷：(1)炎癥反應(yīng)因子促進(jìn)中性粒細(xì)胞及黏附分子激活與表達(dá)，介導(dǎo)與心肌細(xì)胞結(jié)合，損傷心??；(2)炎癥反應(yīng)中可生成大量的氧自由基，造成心肌進(jìn)一步損傷〔8〕；(3)炎癥遞質(zhì)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附穿過內(nèi)皮遷移至心肌缺血部位，可阻塞毛細(xì)血管，使心肌微循環(huán)的損傷程度加重，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，增大梗死面積。

殼聚糖是一種白色或灰白色無味、無毒、略帶珍珠光澤、半透明的片狀或粉狀固體，它分子呈線狀，極性強(qiáng)，易結(jié)晶。它不溶于水和堿性溶液，但可溶于酸性溶液，當(dāng)它與稀酸作用時(shí)呈黏糊狀，帶正電荷且慢慢水解，故殼聚糖一般是隨用隨配。WSC是殼聚糖脫乙酰反應(yīng)的產(chǎn)物，在無需其他化學(xué)修飾的情況下就能夠溶于水中因而它獨(dú)特的生理活性和物化性質(zhì)更容易得到體現(xiàn)，且保留原殼聚糖的生物學(xué)功能〔9〕。Hou等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)WSC能促進(jìn)成骨細(xì)胞功能，如堿性磷酸酶活動(dòng)，細(xì)胞生存能力和礦化，這一過程是通過抗氧化活性進(jìn)而減少或防止成骨細(xì)胞變性來實(shí)現(xiàn)的。Chung等〔10〕發(fā)現(xiàn)WSC有抑制過敏性哮喘炎癥反應(yīng)的作用。本實(shí)驗(yàn)說明WSC能逆轉(zhuǎn)心肌IRI，對(duì)IRI大鼠心肌具有保護(hù)作用。這種作用可能與對(duì)抗IRI時(shí)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。目前有關(guān)WSC抗IRI時(shí)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)4

1春玉虎，黨宏偉，閆業(yè)軍.番茄紅素對(duì)大鼠心臟缺血再灌注的保護(hù)作用及其機(jī)制研究〔J〕.現(xiàn)代藥物與臨床，2014；29(9)：974-9.

2孫莉，荀平.西洋參莖葉皂苷抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014；20(24)：176-9.

3鐘偉，王永剛，于遠(yuǎn)望，等.雙參通冠方對(duì)心肌缺血再灌注模型大鼠炎癥因子及血管內(nèi)皮功能的影響〔J〕.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013；36(1)：67-9.

4Xia Z，Wu S,Chen J.Preparation of water soluble chitosan by hydrolysisusing hydrogen peroxide〔J〕.Int J Biol Macromol，2013；59(3)：242-5.

5Ji Q，Deng J，Yu X，etal.Modulation of pro-inflammatory mediators in LPS-stimulated human periodontal ligament cells by chitosan and quaternized chitosan〔J〕.Carbohydr Polym，2013；92(7)：824-9.

6Liu J,Wen XY，Lu JF，etal.Free radical mediated grafting of chitosan with caffeic and ferulic acids：structures and antioxidant activity〔J〕.Int J Biol Macromol，2014；65(2)：97-106.

7Hou JW，Qian L，Kou JM，etal.Effect of water-soluble chitosan on the osteoblast function in MC3T3-E1 cells〔J〕.Int J Biol Macromol，2015;72(11)：1041-3.

8夏世金，孫濤，吳俊珍.自由基、炎癥與衰老〔J〕.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2014;28(2)：100-3.

9Ma JX，Qian L，Zhou Y.Stimulation effect of chitosan on the immunity of radiotherapy patients suffered from lung cancer〔J〕.Int J Biol Macromol，2015;72(2)：195-8.

10Chung MJ，Park JK，Park YI.Anti-inflammatory effects of low-molecular weight chitosan oligosaccharides in IgE-antigen complex-stimulated RBL-2p cells and asthma model mice〔J〕.Int Immunopharmacol，2012;12(2)：453-9.

〔2015-06-19修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：任彥鋒(1987-)，男，碩士，主要從事心血管疾病基礎(chǔ)研究。

基金項(xiàng)目：吉林省自然科學(xué)基金資助(201215058)

中圖分類號(hào)〔〕R541.4〔

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

文章編號(hào)〕1005-9202(2015)21-6056-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.022