人參皂苷Re對慢性缺血致血管性癡呆大鼠行為學(xué)及形態(tài)學(xué)的影響

孔祥怡　郝利銘　蘇曉薇　姜文華　矯春寶　任　翔　趙　晴　徐忠信

(吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,吉林　長春　130021)

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人參皂苷Re對慢性缺血致血管性癡呆大鼠行為學(xué)及形態(tài)學(xué)的影響

孔祥怡郝利銘1蘇曉薇1姜文華1矯春寶2任翔2趙晴3徐忠信3

(吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,吉林長春130021)

摘要〔〕目的探討人參皂苷Re對慢性血管性癡呆(VD)大鼠的保護(hù)作用。方法應(yīng)用分次離斷結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈造模法建立VD大鼠模型，利用Morris 水迷宮、HE染色和電鏡技術(shù)觀察人參皂苷Re的保護(hù)效果。結(jié)果分次離斷結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈后，大鼠認(rèn)知能力下降，逃避潛伏期明顯延長，神經(jīng)細(xì)胞明顯收縮，游離核糖體較多，細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)空泡化。不同濃度人參皂苷Re可明顯修復(fù)海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷。結(jié)論人參皂甙Re可顯著改善大鼠認(rèn)知能力，對腦血管缺血所造成的神經(jīng)元損傷具有一定修復(fù)作用。

關(guān)鍵詞〔〕人參皂苷；血管性癡呆；慢性缺血

1吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部組織胚胎學(xué)系

2吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)系

3吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

趙晴(1969-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病及癡呆研究。

第一作者：孔祥怡(1995-)，女，本科在讀，主要從事腦血管疾病及癡呆研究。

我國血管性癡呆(VD)年發(fā)病率為5‰～9‰。西藥治療主要是應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑及促進(jìn)腦代謝藥物等，但可引發(fā)副作用，如神經(jīng)精神異常及癲癇發(fā)作等〔1〕。人參皂苷(Ginsenoside)是一種固醇類化合物，主要存在于人參屬藥材中。它含有多種成分，其中人參皂苷Re為四環(huán)三萜類衍生物，具有抑制中樞神經(jīng)、促進(jìn)DNA和RNA合成、升高血漿皮質(zhì)酮和擴(kuò)張血管等作用〔2〕。人參皂苷 Re具有抑制心肌細(xì)胞凋亡、抗缺血性心律失常和保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用〔3，4〕。本實(shí)驗(yàn)擬探討人參皂苷Re對慢性缺血性VD大鼠的保護(hù)作用。

1材料和試劑

1.1實(shí)驗(yàn)動物、主要藥品與試劑 Wistar 雄性大鼠，體重180～220 g，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心，質(zhì)量合格證號：SCXK-(吉)2008-0005。飼養(yǎng)在24～26℃室溫，正常光照、標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。人參皂苷 Re(含量98%,20141118)由吉林大學(xué)化學(xué)中心天然藥物化學(xué)研究室提供。水合氯醛購于天津化學(xué)試劑三廠。注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)購于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院。

1.2模型制備應(yīng)用分次離斷結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈造模法建立VD大鼠模型。水迷宮篩選后第3天，給予造模組10%水合氯醛3～3.5 ml/kg體重，腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺，將手術(shù)區(qū)消毒，并沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總動脈,用0號手術(shù)線結(jié)扎動脈的遠(yuǎn)心端與近心端,并從中間剪斷，然后逐層縫合，術(shù)后1 w內(nèi)每天肌肉注射青霉素預(yù)防感染。1 w后依同樣方法結(jié)扎左側(cè)頸總動脈。假手術(shù)組在同樣條件下，只鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，其他操作同前。手術(shù)期間嚴(yán)密觀察大鼠呼吸變化，確保有自主呼吸。術(shù)后死亡。

1.3分組與給藥健康雄性Wistar鼠 80 只，造模后隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、模型組(M 組)、多奈派齊組、人參皂苷 Re 高劑量組 20 mg/kg、中劑量組 10 mg/kg和低劑量組 5 mg/kg。每組12只。每日灌胃給予相應(yīng)藥物，1次/ d ，連續(xù)給藥30 d和90 d。S組和M組同期灌胃相應(yīng)體積蒸餾水。

1.4Morris 水迷宮篩查〔5，6〕Morris 水迷宮的裝置由一不銹鋼圓形水池通過攝像機(jī)與電腦連接所組成。水池內(nèi)壁被漆為黑色，直徑160 cm，高50 cm，水深30 cm，水溫保持在(26±2)℃。在目標(biāo)象限(設(shè)為第三象限)內(nèi)放有一個(gè)直徑為12 cm，高29 cm的圓形黑色站臺，位于水面下1 cm。實(shí)驗(yàn)在隔音、光線昏暗房間內(nèi)進(jìn)行，且環(huán)境在整個(gè)水迷宮實(shí)驗(yàn)階段保持不變。訓(xùn)練時(shí)，將大鼠面向池壁，固定選取離平臺最遠(yuǎn)象限作為入水點(diǎn)，記錄大鼠在2 min內(nèi)尋找到平臺的軌跡和時(shí)間(逃避潛伏期)。如果超過2 min仍未找到平臺，潛伏期計(jì)為120 s，結(jié)束后，試驗(yàn)者可以引導(dǎo)大鼠找到平臺，并停留10 s。試驗(yàn)完后將大鼠放回鼠籠中。然后重新入水測試，直至全部2個(gè)入水點(diǎn)測試完畢。計(jì)算2次入水逃避潛伏期的平均值，作為該天該大鼠的成績。訓(xùn)練連續(xù)5 d，每天訓(xùn)練1次，以搜索持續(xù)時(shí)間(逃避潛伏期)作為衡量大鼠記憶功能的標(biāo)準(zhǔn)，將得到的5組數(shù)據(jù)兩兩比較，以剔除個(gè)別不會游泳及在5次測試成績均很差且無明顯改善的大鼠。檢測時(shí)，對造模后分別灌胃給藥1個(gè)月和3個(gè)月的大鼠同樣采用該方法測試學(xué)習(xí)記憶改善能力，記錄尋找到平臺的軌跡和時(shí)間。

1.5HE染色大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出腦組織，經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，并蘇木精-伊紅染色(HE染色)，Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織結(jié)構(gòu)并顯微攝影。

1.6電鏡樣本的制備大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速取出腦組織，取2 mm×2 mm×2 mm大小的右側(cè)海馬CA1區(qū)組織一塊，置于2.5%戊二醛預(yù)固定,然后入1%鋨酸繼續(xù)固定,經(jīng)70%、80%、95%乙醇、無水丙酮脫水，環(huán)氧樹脂 Epon812 浸透和包埋,LKB-I 型超薄切片機(jī)切片,3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,于日立 H-600透射電子顯微鏡觀察海馬組織的結(jié)構(gòu)變化。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1定位航行試驗(yàn)一般訓(xùn)練3 d后，大鼠逃避潛伏期基本趨于穩(wěn)定，遂以 4～6 d的逃避潛伏期平均成績?yōu)樵囼?yàn)數(shù)據(jù)。與S組比較，M組潛伏期明顯延長，提示雙側(cè)頸總動脈離斷在一定程度上造成了大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙。不同濃度Re組與M組比較,潛伏期均明顯縮小，其中以低劑量Re組和高劑量Re組為最好(P<0.05)；中劑量Re組僅在給藥1個(gè)月時(shí)表現(xiàn)出差異。表明，Re在一定時(shí)間和濃度下可提高VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。見表1。

表1　各組逃避潛伏期比較

與S組比較:1)P<0.01;與M組比較:2)P<0.05

2.2HE染色結(jié)果S組海馬各區(qū)細(xì)胞排列均勻整齊，神經(jīng)細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞核大而圓、染色淺，核仁清晰。M組術(shù)后1個(gè)月，CA1、CA2、CA3和CA4區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生收縮，細(xì)胞體積變小，部分神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色加深；術(shù)后3個(gè)月，細(xì)胞體積有所增加。低劑量Re組術(shù)后1個(gè)月，神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞體積均有輕微增加，細(xì)胞間隙變化不大；術(shù)后3個(gè)月，神經(jīng)細(xì)胞體積繼續(xù)增加，膠質(zhì)細(xì)胞染色也開始變淺。中劑量Re組術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月，神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞體積較低劑量Re組變化不明顯。高劑量Re組術(shù)后1個(gè)月和3個(gè)月，神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞體積比M組顯著增大，細(xì)胞核染色淺，核仁清晰，同時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色變淺(圖1)。

2.3超微結(jié)構(gòu)結(jié)果S組細(xì)胞核圓形、染色淺，無異染色質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)核糖體多，線粒體無空泡狀，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核中央為常染色質(zhì)、異染色質(zhì)位于核膜附近，核仁清晰，毛細(xì)血管周圍的膠質(zhì)細(xì)胞偶見水腫。神經(jīng)元間存在突觸，突觸位于神經(jīng)氈中。M組術(shù)后1個(gè)月，細(xì)胞核染色較淺，近核膜處偶見異染色質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量核糖體，線粒體或局部空泡狀，或整個(gè)線粒體呈空泡狀，可見電子密度大的結(jié)構(gòu)；海馬內(nèi)毛細(xì)血管周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞處于嚴(yán)重水腫狀態(tài)，同時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)有大量溶酶體。與術(shù)后1個(gè)月相比，術(shù)后3個(gè)月有所恢復(fù)，此時(shí)，神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體空泡狀線粒體減少，溶酶體減少，血管周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞水腫減輕。神經(jīng)元間存在突觸，突觸位于神經(jīng)氈中，其結(jié)構(gòu)同S組無顯著差別。Re組術(shù)后1個(gè)月，神經(jīng)細(xì)胞核染色淺，少量異染色質(zhì)位于核膜或散在于細(xì)胞核中，線粒體較多、偶見空泡狀；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞核染色淺、異染色質(zhì)減少，核仁清晰，常染色質(zhì)增加；毛細(xì)血管周圍的線粒體仍然呈水腫狀，但較M組減輕。術(shù)后3個(gè)月，神經(jīng)細(xì)胞核染色淺，偶見異染色質(zhì)，核仁清晰，線粒體多、偶見空泡化；毛細(xì)血管周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有少量水腫，但較給藥1個(gè)月時(shí)明顯減輕神經(jīng)元間存在突觸，突觸位于神經(jīng)氈中，其結(jié)構(gòu)同S組與M組無顯著差別。見圖2。

圖1　各組海馬結(jié)構(gòu)染色結(jié)果(HE)

圖2　各組海馬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

3討論

VD是腦血管疾病(多為腦血管供血不足)導(dǎo)致的記憶、認(rèn)知功能障礙臨床綜合征，是老年人中最常見的癡呆類型之一〔7〕。由于老年人的血管普遍出現(xiàn)不同程度狹窄、使得腦細(xì)胞代謝和功能出現(xiàn)異常變化，部分患者出現(xiàn)VD。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是評價(jià)動物學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。研究證實(shí)〔8，9〕，血管性認(rèn)知功能障礙與慢性腦缺血引起的海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)，當(dāng)頸總動脈雙側(cè)結(jié)扎離斷后，急性腦缺血可使海馬區(qū)得不到正常血液供應(yīng)，使海馬神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的變化，從而形成記憶障礙。而改善缺血功能，促進(jìn)血液循環(huán)，可修復(fù)海馬神經(jīng)元的損傷。據(jù)報(bào)道〔10〕，應(yīng)用電針治療VD小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)，電針刺激可使海馬錐體神經(jīng)細(xì)胞脫失減少，細(xì)胞核固縮；電子顯微鏡下，大鼠神經(jīng)元細(xì)胞核完整，細(xì)胞質(zhì)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，游離核糖體多，部分線粒體嵴斷裂、模糊或消失。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VD大鼠神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)水腫。缺血后，神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞代謝方式轉(zhuǎn)變，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷較重，線粒體能量供給減少，這與上述文獻(xiàn)結(jié)果相似。人參皂苷 Re是從人參藥材中提取出來的具有較高活性的天然成分。它具有抗缺血性心律失常和保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用〔11〕。本研究結(jié)果提示，人參皂甙Re可對大鼠的認(rèn)知能力有顯著改善，對腦血管缺血所造成的神經(jīng)元損傷具有一定修復(fù)作用。

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〔2014-11-17修回〕

(編輯張慧)

通訊作者：徐忠信(1965-)，男，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，教授，主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病研究。

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳項(xiàng)目(No.20130727029YY);吉林省發(fā)改委項(xiàng)目(No.20150204057SF)

中圖分類號〔〕R749.13〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6033-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.013