生長激素釋放肽6對心衰模型大鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt/Caspase-9信號通路蛋白表達(dá)的影響

陳立強(qiáng)　徐振宇　韓　曦　李梅秀　田國忠

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江　佳木斯　154007)

?

生長激素釋放肽6對心衰模型大鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt/Caspase-9信號通路蛋白表達(dá)的影響

陳立強(qiáng)徐振宇韓曦李梅秀田國忠

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007)

摘要〔〕目的研究生長激素釋放肽(GHRP)-6對心力衰竭模型大鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt/Caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)的影響及保護(hù)作用機(jī)制。方法清潔級SD大鼠100只隨機(jī)分為正常對照(A)組、假手術(shù)(B)組、模型(C)組和GHRP-6治療(E)組。采用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支制備心力衰竭模型，免疫組化法(SABC)檢測各組左心室心肌細(xì)胞PI3K p110α、Akt p-Ser308和Caspase-9的表達(dá)情況。結(jié)果C組左心室心肌細(xì)胞中PI3K p110α和Akt p-Thr308 陽性表達(dá)量較A組、B組顯著降低(P<0.05)，D組較C組顯著升高(P<0.05)；C組Caspase-9陽性表達(dá)量較A組、B組顯著增加(P<0.05)，D組較C組顯著降低(P<0.05)。結(jié)論GHRP-6通過調(diào)控PI3K/Akt/Caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來發(fā)揮其保護(hù)心肌的作用。

關(guān)鍵詞〔〕生長激素釋放肽(GHRP)-6；心力衰竭；PI3K；Akt；Caspase-9

第一作者：陳立強(qiáng)(1979-)，男，實(shí)驗(yàn)師，在讀碩士，主要從事心力衰竭分子機(jī)制研究。

心肌死亡(壞死、凋亡、自噬等)的發(fā)生和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活所致的系統(tǒng)反應(yīng)是心力衰竭發(fā)展過程主要因素，有效抑制這兩個(gè)過程的發(fā)生和發(fā)展是預(yù)防和治療心力衰竭的基礎(chǔ)〔1，2〕。心力衰竭時(shí)，凋亡因子介導(dǎo)的各類凋亡途徑均可以激活半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)-9，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，繼而激活下游的Caspase-3和Caspase-7，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是廣泛存在于細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，Caspase-9是Akt下游的直接靶蛋白，PI3K/Akt可以通過直接或間接方式抑制其活性，從而抑制Caspase-9的促凋亡作用〔3〕。生長激素釋放肽(GHRPs)是一類人工合成的具有刺激生長激素(GH)釋放功能的氨基酸短肽，通過增加GH/胰島素樣生長因子(IGF)-1分泌來調(diào)控心臟收縮、心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞肥大等。本實(shí)驗(yàn)探討GHRP-6對心力衰竭模型大鼠心肌細(xì)胞PI3K/Akt/Caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白表達(dá)的影響及其保護(hù)作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物和分組清潔級SD大鼠100只，2～3個(gè)月齡，體重(188.3±21.8)g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，常規(guī)飼養(yǎng)。隨機(jī)分為正常對照組(A組)、假手術(shù)組(B組)、模型組(C組)和GHRP-6治療組(D組)，每組25只。

1.2主要藥物和試劑GHRP-6，大連美侖生物技術(shù)有限公司；PI3K p110α和Caspase-9抗體，武漢博士德生物工程有限公司；Akt p-Thr308抗體，ExCell生物公司。

1.3造模與用藥C組和D組：結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支制備心力衰竭模型，B組：左冠狀動脈前降支穿線，不結(jié)扎。造模4 w后，D組按100 μg·kg-1·d-1劑量尾靜脈注射GHRP-6溶液，其余組尾靜脈注射等量生理鹽水，連續(xù)注射4 w。

1.4取材與檢測給藥4 w末，腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后摘除心臟，置于10%的中性甲醛溶液中，固定72 h。制作石蠟切片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SABC法)檢測心肌PI3K p110α、Akt p-Thr308和 Caspase-9的表達(dá)情況，陽性表達(dá)為胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。使用IPP 6.0圖像分析軟件計(jì)算陽性染色的平均光密度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和雙變量相關(guān)分析，兩兩比較采用LSD和SNK檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1免疫組化染色結(jié)果C組左心室心肌細(xì)胞中PI3K p110α陽性表達(dá)量較A、B組顯著降低(P<0.05)，D組較C組陽性表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；C組Akt p-Thr308陽性表達(dá)量較A組、B組顯著降低(P<0.05)，D組較C組陽性表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；C組Caspase-9陽性表達(dá)量較A組、B組顯著增加(P<0.05)，D組較C組陽性表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

表1　各組心肌細(xì)胞內(nèi)PI3K p110α、Akt p-Thr308和

與A、B組比較：1)P<0.05；與C組比較：2)P<0.05

2.2PI3K p110α與Akt p-Thr308及Akt p-Thr308與Caspase-9相關(guān)性心肌細(xì)胞內(nèi)PI3K p110α與Akt p-Thr308陽性表達(dá)量呈高度正相關(guān)(r=0.829，P<0.05)；Akt p-Thr308與Caspase-9陽性表達(dá)量呈中度負(fù)相關(guān)(r=-0.556,P<0.05)。見圖2。

圖1　各組心肌細(xì)胞內(nèi)PI3K p110α、Akt p-Thr308和 Caspase-9蛋白表達(dá)(SABC，×400)

3討論

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在細(xì)胞中，在心力衰竭的發(fā)病過程中其對于心肌細(xì)胞的生存、凋亡、心肌重構(gòu)和炎癥反應(yīng)等一系列心肌保護(hù)作用的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用。PI3K的激活依賴于受體酪氨酸激酶的活化和依賴于G蛋白耦聯(lián)受體的活化〔4〕，一些生長因子(如IGF)的受體本身具有酪氨酸激酶活性(RTK)，被磷酸化激活的酪氨酸殘基與PI3K p85亞基上的Sp結(jié)構(gòu)域結(jié)合，p85與其結(jié)合后對異二聚體中PI3K p110的抑制作用解除，導(dǎo)致PI3K活化。GHRPs具有促進(jìn)GH分泌的作用，能促使心肌表面IGF-1的分泌增加，IGF-1可以直接激活PI3K〔4〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PI3K在正常心肌細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，心力衰竭時(shí)，各種刺激因素導(dǎo)致PI3K活性受到抑制，GHRP-6可以明顯提高PI3K的活性。

激活的PI3K通過激活PIP3，使其與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合暴露Thr308和Ser473位點(diǎn)，在PDK1/2的輔助下，使Thr308和Ser473位點(diǎn)磷酸化而激活A(yù)kt〔5〕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Akt的活性程度與PI3K的活性程度相一致，Akt的活性直接受PI3K的調(diào)控，GHRP-6可以通過激活PI3K來調(diào)控Akt的活性。

心肌細(xì)胞凋亡是心力衰竭時(shí)重要的發(fā)病機(jī)制，各種凋亡因素可以引起線粒體膜通透性改變而造成細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1結(jié)合，形成多聚復(fù)合體，通過募集胞質(zhì)中的procaspase-9，使其自我剪切活化成有活性的Caspase-9，繼而啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；Caspase-9是Akt的直接靶蛋白，活化的PI3k/Akt信號通路可以使Caspase-9的Ser196位點(diǎn)磷酸化，導(dǎo)致Caspase-9失活，使其不能剪切、活化下游的procaspase-3，而抑制其引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)的促凋亡作用〔6〕。實(shí)驗(yàn)報(bào)道〔7〕證實(shí)，在心衰動物模型和細(xì)胞模型中通過調(diào)控PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以抑制Caspase-9和Caspase-3表達(dá)，降低了心肌細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GHRP-6作用于心力衰竭模型大鼠后，可以通過激活PI3K啟動下游靶蛋白Akt，激活的Akt抑制Caspase-9的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，推測GHRP-6可能通過調(diào)控PI3K/Akt/Caspase-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來發(fā)揮其保護(hù)心肌的作用。但鑒于心力衰竭時(shí)PI3K/Akt調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，要探究GHRPs對于其更詳細(xì)的作用機(jī)制，需要深入研究。

參考文獻(xiàn)4

1中華醫(yī)學(xué)會心血管分會，中華心血管病雜志編輯委員會.中國心力衰竭診斷和治療指南2014〔J〕.中華心血管病雜志，2014；42(2)：98-122.

2Shah AM，Mann DL.In search of new therapeutic targets and strategies for heart failure：recent advances in basic science〔J〕.Lancet，2011；378(9792)：704-12.

3李敏，林俊.細(xì)胞凋亡途徑及其機(jī)制〔J〕.國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2014；41(2)：103-7.

4Denley A，Gymnopoulos M，Kang S，etal.Requirement of phosphatidylinositol(3，4，5) trisphosphate in phosphatidylinositol 3-kinase-induced oncogenic transformation〔J〕.Mol Cancer Res，2009；7(7)：1132-8.

5Chen J，Alberts I，Li X.Dysregulation of the IGF-I/PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in autism spectrum disorders〔J〕.Int J Dev Neurosci，2014；35(1)：35-41.

6劉玉梅，祖桂芳，趙曉紅，等.Akt/PKB抗凋亡機(jī)制與天然活性物質(zhì)的抗腫瘤作用〔J〕.生命科學(xué)，2011；23(1)：1-6.

7Hussain A，Gharanei AM，Nagra AS，etal.Caspase inhibition via A3 adenosine receptors：a new cardioprotective mechanism against myocardial infarction〔J〕.Cardiovasc Drugs Ther，2014；28(1)：19-32.

〔2014-07-19修回〕

(編輯苑云杰)

The effects of GHRP-6 on PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway in myocardial cells of heart failure rats

CHEN Li-Qiang, XU Zhen-Yu, HAN Xi,etal.

College of Basic Medical Sciences, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang, China

【Abstract】ObjectiveTo study the protective mechanism of growth hormone-releasing peptide (GHRP)-6 on myocardial cells of rats with congestive heart failure by observating the effects of GHRP-6 on heart functions and PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway. Methods100 healthy SD rats were divided into 4 groups randomly: control group (A), sham group (B), heart failure group (C) and GHRP-6 treated group (D). The left anterior descending coronary artery was ligated to produce heart failure model. The expression of PI3K p110α, Akt p-Ser308 and Caspase-9 were detected by immunohistochemical method(SABC). ResultsThe expression of PI3K p110α and Akt p-Thr308 in left ventricular posterior wall and interventricular septum of C group was decreased than that of A and B groups (P<0.05), the expression level in D group was higher than that of C groups(P<0.05). The caspase-9 level of C group was higher than that of A and B groups (P<0.05) and the expression level in D group lower than that of C group(P<0.05). ConclusionsGHRP-6 can protect the myocardium via regulating PI3K/Akt/Caspase-9 signaling pathway.

【Key words】GHRP-6; Heart failure; PI3K; Akt; Caspase-9

通訊作者：田國忠(1966-)，男，教授，醫(yī)學(xué)博士，博士生導(dǎo)師，主要從事心臟神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)控研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81370342)；佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(No.LZZ2014003)

中圖分類號〔〕R541.6〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6005-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.002