慢性鋁暴露對大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB活性的影響

宋　楊　張海燕　孫雅萍　郭慶國　孟　欣　王　彪

(沈陽市第四人民醫(yī)院，遼寧　沈陽　110120)

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慢性鋁暴露對大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB活性的影響

宋楊張海燕1孫雅萍郭慶國2孟欣2王彪2

(沈陽市第四人民醫(yī)院，遼寧沈陽110120)

摘要〔〕目的通過研究慢性鋁暴露對大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB活性的影響，探討慢性鋁暴露誘導(dǎo)神經(jīng)損傷可能存在的機制。方法選用60只斷乳后雄性Wistar大鼠，分為3組，每組20只；設(shè)定其中1組為對照組，用蒸餾水喂養(yǎng)；其他2組為鋁暴露組，分別用含有0.2%和0.4% AlCl3的蒸餾水喂養(yǎng)3個月。Morris 水迷宮測定各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；Fura-2/AM測定各組大鼠海馬神經(jīng)細胞自由Ca2+濃度變化；Western印跡方法檢測各組大鼠海馬中CaMKⅡ、Ng和CREB的蛋白表達情況。結(jié)果大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低；與對照組相比，鋁暴露各組海馬神經(jīng)細胞中〔Ca2+〕i呈劑量依賴性升高；CaMKⅡ和CREB總蛋白表達無顯著變化，但p-CaMKⅡ、Ng和p-CREB蛋白表達顯著降低(P<0.05)。結(jié)論慢性鋁暴露損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶可能與上調(diào)Ca2+及抑制CaMKⅡ和CREB活性相關(guān)。

關(guān)鍵詞〔〕鋁；鈣；鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ；cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；海馬

1中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年病教研室

2中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

第一作者：宋楊(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。

鋁(Al)是一種慢性神經(jīng)毒性物質(zhì)，隨著鋁的生物利用度增加，其與許多神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)，包括阿爾茨海默病(AD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、帕金森癡呆和海灣戰(zhàn)爭綜合征〔1，2〕。動物實驗證明，Al鹽可引起許多動物腦內(nèi)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)病理變化，如兔〔3〕、貓〔4〕、小鼠〔5〕、大鼠〔6〕和猴〔7〕。最新的研究結(jié)果也證明，Al暴露可導(dǎo)致腦內(nèi)產(chǎn)生AD樣病理變化以及認知障礙〔8，9〕，并且飲水中Al含量與AD患者死亡率呈正相關(guān)〔10〕。慢性Al暴露可以增強AD患者腦內(nèi)NFT和Aβ的形成，從而增加淀粉樣斑塊的體積和數(shù)量〔11〕。在神經(jīng)元中，鈣離子(Ca2+)持續(xù)性升高可造成神經(jīng)毒性，與急慢性神經(jīng)退行性病變中的神經(jīng)損傷密切相關(guān)〔12〕。神經(jīng)元內(nèi)的Al可以影響靜息Ca2+水平，減慢Ca2+流出細胞質(zhì)〔13〕。同時，Al可以抑制調(diào)節(jié)Ca2+的相關(guān)蛋白表達。因此，了解鋁暴露對Ca2+穩(wěn)態(tài)的影響對于明確鋁神經(jīng)毒性的機制，具有十分重要的意義。Ca2+/鈣調(diào)蛋白(CaM)依賴的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是神經(jīng)細胞興奮性轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的關(guān)鍵媒介，也是突觸可塑性改變的關(guān)鍵蛋白〔14〕。此外，cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)是CaMKⅡ的下游分子之一，在突觸可塑性中具有重要作用，激活CREB可促進多種與突觸可塑性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄〔15〕，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生一些與學(xué)習(xí)記憶十分相關(guān)的蛋白分子。研究表明，Al在腦內(nèi)特定的敏感區(qū)域內(nèi)選擇性地沉積〔16〕，如海馬區(qū)等。但是，慢性Al暴露對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)以及其下游CaMKⅡ、CREB信號分子活性的影響尚未見報道。本文通過對慢性Al暴露影響大鼠海馬神經(jīng)元Ca2+及其下游CaMKⅡ、CREB信號分子的觀察，探討Al誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的可能機制。

1材料與方法

1.1主要材料選擇60只斷乳后Wistar大鼠(體重約30 g)，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。CREB抗體、磷酸化(p)-CREB抗體(Cell Signal公司)；CaMKⅡ抗體、p-CaMKⅡ抗體、神經(jīng)顆粒素(Ng)抗體(美國SANTA Cruz公司)、β肌動蛋白(β-actin)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(北京中杉生物公司)；ECL發(fā)光試劑(美國Sigma公司)、Chemilmager 5500 V2103(美國)。其他試劑均為分析純。

1.2動物模型建立將60只(AlCl3)大鼠隨機分3組，每組20只。對照組用蒸餾水喂養(yǎng)，Al暴露組分別用含有0.2%和0.4%氯化鋁的蒸餾水喂養(yǎng)。動物室溫度保持在18℃～23℃、相對濕度為45%～55%，光照時間12 h∶12 h。Al暴露大鼠保持健康，體重為對照大鼠的(90±6)%。3個月后，進行大鼠學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)及其他生化指標(biāo)測定。

參考文獻1.3Morris 水迷宮測定大鼠學(xué)習(xí)記憶行為〔17〕的方法，Morris水迷宮測試在內(nèi)徑180 cm、高60 cm的圓形水池中進行。水深48 cm，水溫為(22±0.5)℃，水池內(nèi)放入奶粉使之成為乳白色。將水池分為西南、西北、東南和東北(SW、NW、SE和NE)四個象限，NW象限正中距池壁20 cm處放置逃避平臺(直徑約8 cm)，平臺位于水下2 cm。水池正上方安裝帶有顯示系統(tǒng)的攝像機，計算機自動跟蹤計時并記錄游泳軌跡，實驗期內(nèi)迷宮外參照物保持不變。Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分，根據(jù)相關(guān)文獻〔17〕，簡單地說，實驗大鼠每天游泳4次，分別從不同象限將動物頭朝池壁入水，并在水池上標(biāo)定相同一點作為每次實驗大鼠的入水點，尋找平臺時間上限設(shè)置為120 s。如果在規(guī)定時間內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引導(dǎo)至平臺并停留30s以加強記憶，緩解緊張情緒。逃避潛伏期記錄為120 s，每只大鼠的游泳時間間隔為15 min。觀察和記錄120 s內(nèi)大鼠穿越平臺的次數(shù)、在原平臺象限搜索時間占總時間的百分比和在原平臺象限搜索距離占總距離的百分比，并記錄大鼠在120 s內(nèi)搜索平臺的路線圖?？臻g探索實驗只進行1次。 4

1.4腦組織和血液中Al含量測定根據(jù)文獻〔18，19〕，準(zhǔn)確分離并稱取各組大鼠海馬組織(約0.1～0.5 g)或準(zhǔn)確吸取0.2～0.5 ml的全血于石英燒杯中，放入聚四氟乙烯(PTFE)中，加入5～8 ml混酸(硝酸∶高氯酸體積比為4∶1)，同時做空白對照。低溫加熱至試樣全部溶解，繼續(xù)加熱蒸發(fā)至近干后加0.2%硝酸溶解殘留物，并以0.2%硝酸定容至50 ml，采用石墨爐原子吸收分光光度法測定腦鋁或血鋁含量。

1.5大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+含量測定〔20〕冰上分離大鼠海馬組織后，放入D-Hank液中。37℃下用0.125%胰酶消化20 min，反復(fù)吹打后離心，制備密度為106～107個/ml的單細胞懸液。臺盼藍染色，確定分離出的單細胞存活率在95%以上。將終濃度為4 μmol/L的Fura-2/AM加入上述分離出來的細胞懸液中，37℃下孵育35 min后，用含0.2% BSA的Hank液清洗殘留的Fura-2/AM。然后，將細胞重懸于無Mg2+的Hank液中(mmol/L)：HEPES 10，KCl 5.0，NaCl 145，CaCl21.3，L-glucose 10，Na2HPO4。采用日立F-3000型熒光雙波長分光光度計測定細胞Ca2+濃度。激發(fā)光波長設(shè)定為340～380 nm，發(fā)射光波長為510 nm。根據(jù)下面公式計算Ca2+濃度〔Ca2+〕i=Kd〔(R-Rmin)/(Rmax-R)〕(Fmin/Fmax)。Kd值為224 nmol/L，R為熒光值，〔Ca2+〕i為nmol/L，而Fmin為加入EGTA后測得的熒光值，F(xiàn)max為加入TritonX-100后測得的熒光值。

1.6逆轉(zhuǎn)錄實時PCR法檢測mRNA表達冰上分離各組大鼠海馬組織，按照TRIzol說明書(Invitrogen，USA)抽提各組海馬組織的總RNA。應(yīng)用紫外分光光度儀測定RNA樣品260/280 nm波長處吸光度比值為1.9～2.0。根據(jù)試劑盒說明書要求，采用oligo (dT)和super script Ⅱ進行逆轉(zhuǎn)錄后，用雙標(biāo)記熒光探針混合物(SYBR Green PCR Master mix)在ABI prism7500自動序列分析系統(tǒng)(Biosystems)中進行實時定量PCR分析，每組重復(fù)3次。CaMKⅡ基因引物特異序列分別為5′-AGCCATCCTCACCACTAT-3′(上游) 和5′-CTTCACGCCATCATTCTTC-3′(下游)；CREB基因引物特異序列分別為：5′-CCAGCCATCAGTTATTCAGT-3′(上游)和5′-TTACACTATCCACAGACTCCT′(下游)；β-actin 作為內(nèi)參照，其引物特異序列為5′-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3′(上游) 和5′-GGA TCT TCA TGA GGTA GTCA G-3′。兩種基因擴增結(jié)果用β-actin進行標(biāo)化。

1.7免疫印跡檢測蛋白表達采用頸椎脫臼法處死大鼠，冰上分離大鼠海馬，剔除血管。在每個裝有海馬的離心管中，按照1∶9比例加入裂解液(10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaF，1% TritonX-100，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF)，1 μg/ml亮肽素，1 μg/ml抑蛋白酶 (Santa Cruz，USA)，50 mmol/L β-glycerol phosphate，1 mmol/L二硫蘇糖醇和0.09% Brij-35。4℃下超聲粉碎后27 000 g離心1.5 h，取上清，即總蛋白提取液。BCA蛋白定量試劑盒測定樣品蛋白濃度，取50 μg總蛋白，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(110 V，2 h)。待電泳完成后，把蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)上。分別用抗tCREB、p-CREB (Ser133) (1∶100)、Ng(1∶500)、p-CaMKⅡ(1∶500)和β-actin (1∶1 000)抗體孵育，最后加入HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗，ECL發(fā)光并成像分析。

1.8免疫組化檢測蛋白表達各組大鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌流固定后取海馬組織，30%蔗糖(用4%多聚甲醛配置)后固定48 h，冷凍切片 (40 μm/片 )。分別經(jīng)0.3%過氧化氫甲醇溶液、0.3% Triton-100處理后，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次。加入一抗CaMKⅡ(1∶200)4℃孵育過夜、二抗(1∶1 000)室溫下孵育2 h、DAB法顯色。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.0軟件，組間資料統(tǒng)計用單因素方差分析 (ANOVA)。采用單因素重復(fù)測量方差分析評估行為學(xué)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1慢性Al暴露可誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷Morris水迷宮測試結(jié)果表明，與對照組相比較，鋁暴露各組大鼠的穿越平臺次數(shù)、在原平臺象限搜索時間占總時間的百分比和在原平臺象限搜索距離占總距離的百分比顯著降低(P<0.05)；在慢性Al暴露各組之間，0.4% AlCl3組大鼠穿越平臺次數(shù)和搜索距離明顯低于0.2% AlCl3組(P<0.05)，呈現(xiàn)劑量依賴性；各組搜索時間無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

2.2慢性Al暴露可增加大鼠血Al和海馬組織內(nèi)Al的含量與對照組相比較，Al暴露各組大鼠的血液和海馬組織中Al含量明顯增加(P<0.05)；在Al暴露各組大鼠之間，0.4% AlCl3組大鼠的血Al和海馬組織Al含量明顯高于0.2%組(P<0.05)。見表2。

表1　Morris 水迷宮測試結(jié)果

與對照組相比：1)P<0.05；與0.2% AlCl3組相比：2)P<0.05;下表同

表2　各組大鼠血Al和腦Al的比較

血清Al含量測定：n= 10，海馬組織Al含量測定：n=6

2.3慢性Al暴露可增加大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)的自由鈣離子(〔Ca2+〕i)濃度與對照組相比，Al暴露各組大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)〔Ca2+〕i明顯增高，從(155.75 ± 15.33)nmol/L(對照組)分別增至(515.92 ± 53.59)nmol/L(0.2% AlCl3組)和(646.87 ± 62.32)nmol/L(0.4% AlCl3組)；與0.2% AlCl3組相比，0.4% AlCl3組大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)〔Ca2+〕i顯著升高(P<0.05)。

2.4慢性Al暴露對CaMKⅡ和CREB mRNA表達的影響各組CaMKⅡ及CREB mRNA表達無顯著變化(P>0.05)。對照

組設(shè)為1，0.2% AlCl3組與0.4% AlCl3組CaMKⅡ mRNA表達量分別為0.98±0.21、1.11±0.18，CREB mRNA表達量分別為0.99±0.19、1.03±0.15。

2.5慢性Al暴露對CaMKⅡ和CREB總蛋白表達的影響免疫組化結(jié)果顯示，各組CaMKⅡ染色密度元顯著差異(P>0.05)。同時，Western印跡結(jié)果也顯示(圖1)，各組CREB總蛋白表達水平無顯著變化(P>0.05)，CREB總蛋白表達分別為0.55 ± 0.065(對照組)、0.54 ± 0.062(0.2% AlCl3組)和0.57 ± 0.064(0.4% AlCl3組)(P>0.05)。

2.6慢性Al暴露影響學(xué)習(xí)記憶關(guān)鍵蛋白分子CaMKⅡ和CREB的活性與對照組相比，Al暴露組大鼠海馬組織中p-CaMKⅡ、Ng和p-CREB表達水平均明顯降低(P<0.05)；同時，隨著Al暴露濃度的增加，p-CaMKⅡ、Ng和p-CREB表達逐漸降低，呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖2。

圖1　慢性Al暴露對CaMKⅡ和CREB總蛋白表達的影響

與對照組相比:1)P<0.05;與0.2% AlCl3組相比:2)P<0.05圖2　慢性Al暴露對大鼠海馬神經(jīng)元p-CaMKⅡ、Ng和p-CREB表達的影響

3討論

Al暴露因素是AD發(fā)病機制中研究最多的環(huán)境風(fēng)險因素。Al在神經(jīng)系統(tǒng)中的蓄積可產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，從而引起智力和認知能力的缺欠〔21〕。同時，AD患者腦Al含量較高，神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NTFs)中含有高濃度的Al。因此，研究Al暴露與AD的關(guān)系十分重要。

Morris水迷宮行為學(xué)評估結(jié)果證明，慢性Al暴露確實可以造成大鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷，這些結(jié)果與以往國內(nèi)外一些研究的結(jié)果相似〔22〕。

Ca2+對真核細胞的代謝及各種生理功能具有十分重要的作用，并且細胞外Ca2+濃度遠遠高于細胞內(nèi)Ca2+濃度。此外，在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca2+作為最基本的第二信使，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、調(diào)控突觸可塑性，甚至是基因表達〔23〕。有研究表明，Al3+離子半徑與Ca2+相似，可以與Ca2+結(jié)合位點作用，從而在一定程度上影響細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)〔24〕。在體外培養(yǎng)的條件下，Al暴露后可顯著提高星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2+濃度〔25〕。我們的實驗結(jié)果證明，慢性Al暴露可顯著提高大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)的Ca2+濃度，并呈劑量依賴性。此結(jié)果與慢性Al暴露可顯著增加神經(jīng)突觸內(nèi)鈣濃度的研究結(jié)果〔24〕相似。

CaMKⅡ是空間學(xué)習(xí)和記憶的分子基礎(chǔ)，Ca2+內(nèi)流可磷酸化激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ從細胞質(zhì)移動到突觸并結(jié)合NMDA型谷氨酸受體，而CaMKⅡ-NMDA受體復(fù)合物是誘導(dǎo)長時程增強的關(guān)鍵分子〔26，27〕。研究表明，在LTP后期，CaMKⅡ具有放大并強化突觸可塑性的結(jié)構(gòu)性功能〔28〕。我們的結(jié)果證明，慢性Al暴露并未影響大鼠海馬區(qū)CaMKⅡ總蛋白的表達，但是卻降低了p-CaMKⅡ的表達，說明Al暴露可抑制CaMKⅡ的活性。

Ng是一種突觸后蛋白，可以與CaM單體結(jié)合〔29〕，對于CaMKⅡ的活性具有重要的影響。研究表明，Ng增高可以增加CaMKⅡ激活，從而增強突觸可塑性;而在Ng敲除的小鼠中，CaMKⅡ的活性也明顯降低〔30〕。我們的結(jié)果表明，Al暴露可以降低大鼠海馬神經(jīng)細胞中Ng的蛋白表達。因此,總體來說，慢性Al暴露干擾了大鼠海馬神經(jīng)細胞的鈣穩(wěn)態(tài)，降低了p-CaMKⅡ和Ng的蛋白表達，這可能是Al暴露誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶損傷、誘導(dǎo)AD發(fā)病的機制之一。

CREB是一種分子量為43 kD的核轉(zhuǎn)錄因子蛋白，對于神經(jīng)突觸可塑性長時間的改變具有十分重要的作用〔31〕。CREB上的絲氨酸(Ser)133是許多蛋白激酶的作用靶點，例如CaMKⅡ和Ⅳ、蛋白激酶A和蛋白激酶C等。一旦Ser-133位點被磷酸化，CRE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄即刻啟動，從而最終激發(fā)LTP相關(guān)蛋白的合成。本結(jié)果證明，慢性Al暴露顯著抑制p-CREB(S133)的表達，但是CREB總蛋白表達未受到顯著影響。這可能是由于p-CaMKⅡ蛋白的降低抑制了CREB(S133)磷酸化過程。綜上所述，本文結(jié)果表明慢性Al暴露損傷了大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這可能是由于Al暴露造成了海馬神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子紊亂，從而抑制了CaMKⅡ/CREB通路。除此之外，Al暴露還抑制了海馬神經(jīng)細胞的Ng蛋白表達，進一步抑制了CaMKⅡ的激活。

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〔2014-09-15修回〕

(編輯徐杰)

·基礎(chǔ)研究·

Effect of chronic aluminum exposure on calcium homeostasis and activities of CaMKⅡ and CREB in hippocampus of rats

SONG Yang, ZHANG Hai-Yan, SUN Ya-Ping,etal.

Shenyang The Fourth Hospital of People, Shenyang 110120, Liaoning, China

【Abstract】ObjectiveTo study the potential mechanism of aluminum-induced memory injury through the research on effect of chronic aluminum exposure on calcium homeostasis and activities of CaMKⅡ and CREB in hippocampus of rats.Methods60 weaning rats were divided into 3 groups, which were given distilled water containing 0.2% AlCl3and 0.4% AlCl3respectively for 3 months to establish the chronic aluminum exposure model. Morris water maze was used to evaluate the learning and memory ability; the freedom Ca2+in hippocampal neurons of rats was measured with Fura-2/AM; Western blot was used to determine the expressions of CaMKⅡ, Ng and CREB.ResultsLearning and memory abilities of rats were significantly reduced; the expressions of p-CaMKⅡ, Ng and p-CREB in the hippocampus of aluminum-treated groups were significantly lower than those in control group(P<0.05), but there were no changes in the expressions of total CaMKⅡ and CREB; and the aluminum-treated groups had the higher Ca2+level than that of control group(P<0.05).ConclusionsChronic aluminum exposure could impair the ability of learning and memory of rats, which is closely related to the up-regulation of Ca2+level and the down-regulation of CaMKⅡ and CREB activities.

【Key words】Aluminum; Calcium; Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ; cAMP response element binding protein; Hippocampus

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81271292)；遼寧省教育廳基金(2008848)；沈陽市科技局資助項目(F13-220-9-44)

中圖分類號〔〕R749〔

文獻標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6001-05；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.001