阿爾茨海默病復(fù)合動物模型的構(gòu)建

李　嵐　劉　爽　于　燕　寧巧慶　王秀華　張秀麗

(濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，山東　煙臺　264003)

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阿爾茨海默病復(fù)合動物模型的構(gòu)建

李嵐劉爽于燕寧巧慶王秀華張秀麗1

(濱州醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥研究中心，山東煙臺264003)

摘要〔〕目的擬在D-半乳糖(D-gal)致衰老小鼠的基礎(chǔ)上，將亞硝酸鈉/三氯化鋁/脂多糖(NaNO2/AlCl3/LPS)分別組合注射入小鼠體內(nèi)，建立一個較為理想的阿爾茨海默病(AD)復(fù)合模型。方法模型組小鼠給予皮下注射D-gal(150 mg·kg-1·d-1)，分別給予不同組合的NaNO2(90 mg·kg-1·d-1)/AlCl3(25 mg·kg-1·d-1)/LPS(5 mg·kg-1·d-1)；對照組給予皮下注射等量的生理鹽水。利用曠場、跳臺、水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行小鼠行為學(xué)檢測；生化方法檢測超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量；RT-PCR檢測小鼠腦組織Tau和APP mRNA含量。結(jié)果D-gal聯(lián)合NaNO2、AlCl3、LPS能夠引起小鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低；腦組織抗氧化能力降低；腦組織中APP與Tau的 mRNA表達(dá)水平顯著升高。而且，AlCl3+LPS組和NaNO2+AlCl3+LPS組更接近AD病理特征。結(jié)論D-gal聯(lián)合NaNO2、AlCl3、LPS能夠較理想地模擬AD，可用于AD病理和篩選治療藥物的進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞〔〕阿爾茨海默??；亞硝酸鈉；三氯化鋁；脂多糖

1濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院

第一作者：李嵐(1986-)，女，講師，碩士，主要從事神經(jīng)生物學(xué)研究。

依據(jù)阿爾茨海默病(AD)發(fā)病學(xué)說，目前已有各種各樣的AD動物模型，但都存在不同程度的局限性，不能完全模擬AD的特征〔1～3〕。我們設(shè)想在D-半乳糖(D-gal)致衰老動物模型的基礎(chǔ)上輔以能引起老年斑(SP)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的化學(xué)試劑進(jìn)行AD動物模型的探索。研究表明，小鼠給予腹腔注射鋁或口服枸櫞酸鋁均可造成AD模型〔4～6〕；小鼠給予腹腔注射D-半乳糖(D-gal)+亞硝酸鈉(NaNO2)可造AD動物模型〔7,8〕。此外，用脂多糖(LPS)造腦炎模型可用于研究大腦急慢性炎癥在AD發(fā)病過程中的作用〔9,10〕。針對與SP和NFT形成的相關(guān)因素，本實(shí)驗(yàn)先通過對D-gal誘導(dǎo)小鼠衰老，再將AlCl3/NaNO2/LPS進(jìn)行不同組合分別注射于小鼠體內(nèi)，擬建立一種更為理想的、可靠的AD復(fù)合模型。

1材料與方法

1.1試劑和實(shí)驗(yàn)動物D-gal、LPS和DEPC購于Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)生化指標(biāo)檢測試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；引物探針和熒光定量PCR試劑購于ShineGene；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。健康育齡昆明小鼠，雌雄各半，體重(25.0±3.0)g，3月齡，購自煙臺綠葉制藥有限公司。

1.2分組和給藥小鼠分籠喂養(yǎng)于晝夜節(jié)律的溫控室內(nèi)，自由進(jìn)食水，正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行維持5 d的環(huán)境適應(yīng)。隨機(jī)分為正常對照組、模型組Ⅰ(NaNO2+LPS)、模型組Ⅱ(AlCl3+LPS)、模型組Ⅲ(NaNO2+ AlCl3)、模型組Ⅳ(NaNO2+ AlCl3+LPS)，每組10只。四個模型組小鼠分別給予皮下注射D-gal(150 mg·kg-1·d-1)，持續(xù)進(jìn)行6 w；對照組皮下注射等體積生理鹽水。按照分組，分別給予不同模型組小鼠皮下注射NaNO2(90 mg·kg-1·d-1)、AlCl3(25 mg·kg-1·d-1)連續(xù)6 w；末次給藥后第2天，給予相應(yīng)模型組注射LPS(5 mg·kg-1·d-1)。

1.3行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.1曠場實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的運(yùn)動和探究能力。實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求：黑暗、無噪音。將小鼠置于曠場實(shí)驗(yàn)箱，允許其自由探索環(huán)境5 min。觀察記錄小鼠在5 min內(nèi)的行為舉動。主要觀察小鼠跨越的方格總數(shù)目與后肢站立的總次數(shù)(包括兩個前爪騰空或爬上墻壁)。每只實(shí)驗(yàn)動物測試完畢后，需及時進(jìn)行排泄物的清理，以免留有氣味，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3.2跳臺實(shí)驗(yàn)檢測小鼠被動學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)裝置是分隔為五間小鼠跳臺反應(yīng)箱(10 cm×10 cm×30 cm)，箱底裝有銅柵，可通36 V交流電進(jìn)行連續(xù)的電刺激。每個房間的右后角均放有一個直徑和高度為4.5 cm的橡皮墊，作為一個安全區(qū)，避免對小鼠電休克。在實(shí)驗(yàn)中，小鼠被放置在跳臺儀中，適應(yīng)環(huán)境3 min，而后底部銅柵接通36 V的交流電，觀察動物在受到電刺激以后跳躍上橡皮墊的反應(yīng)時間以及在5 min之內(nèi)所受電擊刺激的次數(shù)(錯誤次數(shù))，作為學(xué)習(xí)成績。訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后重做測試，小鼠被放置在跳臺儀中進(jìn)行3 min的環(huán)境適應(yīng)，然后，將老鼠放到橡皮墊上，記錄小鼠第一次跳下橡皮墊的潛伏時間以及在5 min之內(nèi)所受電擊刺激的次數(shù)(錯誤次數(shù))，作為記憶成績。

1.3.3Morris 水迷宮迷宮水池高50 cm，直徑為120 cm，水池上空有與計算機(jī)監(jiān)視器相連接的攝像機(jī)，通過軟件對測試動物進(jìn)行全程追蹤，記錄動物游泳的軌跡，計算機(jī)軟件分析出小鼠游過水池各個象限的路程、在各個象限中所待的時間以及動物找到平臺所需要的時間(即潛伏期)等參數(shù)。水池被等分為4個等大的象限，一個將平臺(直徑10 cm，高17.5 cm)放置于第三象限，沒于水下1 cm，水中倒入墨汁，以實(shí)驗(yàn)動物視覺無法明顯辨別出平臺為宜。在隔音安靜的室內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，水溫以24℃±2℃為宜。

在正式測試前先進(jìn)行5 d的前期訓(xùn)練，4次/d，每次持續(xù)60 s，2次訓(xùn)練之間需間隔60 s。從平臺外的其他三個象限(一、二、四)任選一點(diǎn)將小鼠分別頭面向水池壁放入水中，假如小鼠在60 s之內(nèi)沒有找到平臺，需要人為將它抓到平臺上并停留10 s，再放回籠，此時潛伏期計為60 s。第6天，小鼠在水迷宮內(nèi)接受記憶檢測。試驗(yàn)時撤去平臺，然后將小鼠從平臺對側(cè)頭面向池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)第一次經(jīng)過原平臺的時間(潛伏期)、經(jīng)過平臺次數(shù)及在原平臺所在象限內(nèi)逗留的時間。

1.4取材及樣品制備行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后麻醉動物，生理鹽水經(jīng)心臟做顱內(nèi)灌注，冰上快速分離腦組織，用預(yù)冷的0.9%生理鹽水洗凈。將大腦稱重后，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5SOD活性、GSH-Px酶活力及MDA含量的測定將凍存的右腦組織用冰冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿，4℃、4 000 r/min離心10 min，留上清液備用。測定SOD的活力采用黃嘌呤氧化酶法；測定GSH-Px的活力采用二硫雙硝基苯甲酸法；測定MDA的含量采用硫代巴比妥酸法，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6RT-PCR利用Trizol試劑提取腦組織RNA，RT-PCR檢測腦組織中Tau和APP的mRNA含量。引物序列，APP：上游序列5′-CAGTGAGCCCAGAATCAGCTAC-3′；下游序列：5′-ACAGAGTCCACCCCAAAAGG-3′。Tau：上游序列5′-CACCCCATCCCTACCAACAC-3′；下游序列5′-GCTGGTGCTTCAGGTTCTCA-3′。β-actin：上游序列5′-GAGACCTTCAACACC CCAGC-3′；下游序列5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′。熒光定量PCR反應(yīng)體系：94℃ 4 min；94℃ 20 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，反應(yīng)35個循環(huán)；72℃ 30 s。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理組間比較采用Student-t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.1.1曠場實(shí)驗(yàn)與正常對照組比較，各模型組小鼠跨越的方格總數(shù)和后肢直立次數(shù)均明顯降低(P<0.01)。其中，與模型組Ⅲ相比，模型組Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ在跨格數(shù)和直立次數(shù)上降低的幅度更顯著，見圖1。

2.1.2跳臺實(shí)驗(yàn)與正常對照組比較，各模型組小鼠在記憶獲得測試階段反應(yīng)的時間和出現(xiàn)錯誤的次數(shù)明顯增加多(P<0.05 )。在記憶重現(xiàn)測試中，各模型組小鼠第一次跳下橡皮墊的潛伏期與對照組相比明顯縮小，錯誤次數(shù)明顯增大(P<0.05)。表明各模型組小鼠的被動學(xué)習(xí)記憶能力下降，選擇復(fù)合藥物造模的效果較為理想。見表1。

1～5：正常對照組、模型組Ⅰ、模型組Ⅱ、模型組Ⅲ、模型組Ⅳ，下圖同與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01圖1　曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果

組別 訓(xùn)練 記憶力 反應(yīng)時(s)錯誤次數(shù)潛伏期(s)記憶力正常對照組3.02±1.963.4±0.6203.32±65.021.3±1.3模型組Ⅰ10.72±4.201)5.1±1.31)74.23±43.471)4.3±1.21)模型組Ⅱ11.30±3.481)4.8±1.41)85.34±52.211)4.2±1.81)模型組Ⅲ12.43±3.901)4.7±1.81)93.12±57.101)4.6±1.51)模型組Ⅳ13.11±4.771)5.2±1.91)83.60±62.341)4.7±1.31)

與正常對照組相比：1)P<0.05，下表同

組別SOD組GSH-PxMDA正常對照組300.2±31.93.7±0.63.5±0.8模型組Ⅰ159.4±24.51)1.5±0.31)9.1±0.71)模型組Ⅱ177.3±21.31)1.9±0.21)8.8±0.91)模型組Ⅲ193.62±34.51)1.7±0.181)8.7±1.11)模型Ⅳ191.1±29.41)2.1±0.31)7.5±1.21)

2.1.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)與正常對照組比較，各模型組第一次到達(dá)原平臺的潛伏期較長，在原平臺象限停留的時間較短，穿越原平臺的次數(shù)也相應(yīng)減少(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

2.2腦組織SOD、GSH-Px活力及MDA含量變化相比于正常對照組，各模型組小鼠腦組織中SOD活性和GSH-Px活力均降低(P<0.01)；MDA的含量升高(P<0.01)。見表2。

與正常對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01圖2　Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)空間探索能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3腦組織中APP和Tau的mRNA含量變化與比正常對照組相比，各模型組腦組織中的APP 和 Tau mRNA的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，說明NaNO2/AlCl3/LPS誘導(dǎo)的動物模型能夠較理想的模擬AD。見圖3。

圖3　腦組織中APP和Tau mRNA表達(dá)量

3討論

目前，依據(jù)AD的發(fā)病機(jī)制，提出了多種不同的假說：基因突變和多態(tài)性學(xué)說、能量代謝障礙學(xué)說、Aβ級聯(lián)反應(yīng)學(xué)說等〔11～14〕。現(xiàn)有的AD動物模型有自然衰老模型、損毀模型、轉(zhuǎn)基因模型等，但是，各種模型均僅能在某種程度上進(jìn)行人類AD的模擬，各有不足之處〔15〕。自然衰老動物雖出現(xiàn)學(xué)習(xí)、記憶功能的損傷，但是僅有很少能形成NFT及Aβ沉積；損毀模型雖然可以引起學(xué)習(xí)記憶功能的損傷，但是并不出現(xiàn)SP、NFT，也沒有表現(xiàn)出AD病人全身多系統(tǒng)功能的衰老；轉(zhuǎn)基因動物模型雖然能夠重現(xiàn)類似于AD患者的部分病理改變，但是，只有少數(shù)能呈現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能的損傷，結(jié)果還不令人滿意〔16～20〕。本文擬在D-gal致衰老動物模型的基礎(chǔ)上輔以能引起腦內(nèi)SP和NFT的化學(xué)試劑NaNO2、AlCl3進(jìn)行AD動物模型的探索。因?yàn)檠装Y過程能激活膠質(zhì)細(xì)胞和氧化反應(yīng)，故選擇再加入LPS。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明這三種化合物的不同組合均能引起小鼠探索能力和被動學(xué)習(xí)能力的降低，損傷空間記憶。

Harman〔21〕指出體內(nèi)細(xì)胞正常代謝中產(chǎn)生的過量自由基會損傷DNA和其他大分子引起細(xì)胞死亡并導(dǎo)致退行性疾病，致使機(jī)體衰老、大腦老化。D-gal是機(jī)體的正常營養(yǎng)成分，過量時被轉(zhuǎn)化為損傷神經(jīng)元細(xì)胞的超氧陰離子自由基，進(jìn)而導(dǎo)致腦內(nèi)因子RNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低，引起動物學(xué)習(xí)記憶障礙〔22〕?，F(xiàn)有學(xué)者提出〔23,24〕，AD患者腦內(nèi)β淀粉樣蛋白肽(Aβ)可以促進(jìn)自由基的生成，從而對神經(jīng)元產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。因此研究腦內(nèi)自由基代謝對于揭示AD的發(fā)病機(jī)制是十分重要和必要的。SOD 能夠清除超氧陰離子自由基以保護(hù)細(xì)胞免受其損傷；GSH-Px特異性催化還原型谷胱甘肽對H2O2的還原反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能的完整〔25〕； MDA含量的高低可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度、細(xì)胞的受損傷程度〔26〕。本研究結(jié)果說明腦內(nèi)抗氧化水平明顯降低。

RT-PCR結(jié)果顯示，相比于正常對照組，各模型組小鼠腦組織內(nèi)APP和Tau mRNA的表達(dá)水平顯著升高；而且，AlCl3+LPS組和NaNO2+AlCl3+LPS組升高的程度更為顯著。我們將進(jìn)一步驗(yàn)證這兩種模型與AD的相似性，這種AD復(fù)合模型不需要顱內(nèi)穿孔注射，制作簡單方便，對于AD發(fā)病機(jī)制及相關(guān)藥物篩選的研究具有重要的價值。

參考文獻(xiàn)4

1Wang XP,Ding HL.Alzheimer′s disease:epidemiology,genetics,and beyond〔J〕.Neurosci Bull,2008;24(2):105-9.

2Woodruff-Pak DS.Animal models of Alzheimer′s disease:therapeutic implications〔J〕.Alzheimers Dis,2008;15(4):507-21.

3Peng QL,Bua’Zard AR,Lau BH.Pycnogenol protects neurons from amyloid-β peptide-induced apoptosis〔J〕.Brain Res Mol Brain Res,2002;104(1):55-65.

4謝日青，陶濤，陳民利，等.D-半乳糖致衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶和行為學(xué)觀察及中藥干預(yù)作用〔J〕.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010;20(5):32-6.

5章正，羅煥敏.阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中相關(guān)因素的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年醫(yī)學(xué)雜志,2011;30(3):256-9.

6Mizoroki T,Meshitsuka S,Maeda S,etal.Aluminum induces tau aggregation in vitro but not in vivo〔J〕.Alzheimers Dis,2007;11(4):419-27.

7Shamasundar NM,Rao TS,Naidu MD,etal.A new insight on Al-maltolate-treated aged rabbit as Alzheimer′s animal model〔J〕.Brain Res Rev,2006;52(2):275-92.

8Savory J,Herman MM,Ghribi O.Mechanisms of aluminum-induced neurodegeneration in animals:implications for Alzheimer′s disease〔J〕.Alzheimers Dis,2006;10(2-3):135-44.

9朱燕，周愛玲，茅家慧，等.腦益康對D-半乳糖和亞硝酸鈉所致Alzheimer病小鼠模型的保護(hù)作用〔J〕.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志,2008;24(3):296-300.

10Zhang D,Liu G,Shi J,etal.Coeloglossum viride var.bracteatum extract attenuates D-galactose and NaNO2induced memory impairment in mice〔J〕.Ethnopharmacol,2006;104(1-2):250-6.

11Gao J,Inagaki Y,Liu Y.Research progress on flavonoids isolated from traditional Chinese medicine in treatment of Alzheimer′s disease〔J〕.Intractable Rare Dis Res,2013;2(1):3-10.

12Zhao BS,Liu Y,Gao XY,etal.Effects of ginsenoside Rg1 on the expression of toll-like receptor 3,4 and their signalling transduction factors in the NG108-15 murine neuroglial cell line〔J〕.Molecules,2014;19(10):16925-36.

13Abbasian M,Sayyah M,Babapour V,etal.Intracerebroventricular injection of lipopolysaccharide increases gene expression of connexin32 gap junction in rat hippocampus〔J〕.Basic Clin Neurosci,2013;4(4):334-40.

14Hauptmann S,Keil U,Scherping I,etal.Mitochondrial dysfunction in sporadic and genetic Alzheimer’s disease〔J〕.Exp Gerontol,2006;41(7):668-73.

15Hardy J,Duff K,Hardy KG,etal.Genetic dissection of Alzheimer′s disease and related dementias:amyloid and its relationship to tau〔J〕.Nat Neurosci,1998;1(5):355-8.

16Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease:progress and problems on the road to therapeutics〔J〕.Science,2002;297(5580):353-6.

17Lee VM,Goedert M,Trojanowski JQ.Neurodegenerative tauopathies〔J〕.Annu Rev Neurosci,2001;24:1121-59.

18Bossy-Wetzel E,Schwarzenbacher R,Lipton SA.Molecular pathways to neuro degeneration〔J〕.Nat Med,2004;10(Suppl):S2-S9.

19胡夢琳，戴侃純，張鵬，等.阿爾茨海默病動物模型的研究進(jìn)展〔J〕.解剖學(xué)雜志，2014;37(3):402-4.

20彭彩霞，劉蓉，王建枝.AD轉(zhuǎn)基因模型研究進(jìn)展〔J〕.神經(jīng)損傷與功能重建，2007;2(4):197-202.

21Harman D.Free radical theory of aging:Consequences of mitochondrial aging〔J〕.AGE,1983;6(3):86-94.

22Cui X,Zuo P,Zhang Q,etal.Chronic systemic D-galactose exposure induces memory loss,neurodegeneration,and oxidative damage in mice:protective effects of R-a-Lipoic acid〔J〕.J Neurosci Res,2006;83(8):1584-90.

23Butterfield DA,Lauderback CM.Lipid peroxidation and protein oxidation in Alzheimer′s disease brain:potential causes and consequences involving amyloid beta-peptide-associated free radical oxidiative stress〔J〕.Free Radic Biol Med,2002;32(11):1050-60.

24Yamada K,Tanaka T,Han D,etal.Protective effects of idebenone and alpha-tocopherol on beta amyloid(1-42)-induced learning and memory deficits in rats:implication of oxidiative stress in beta-amyloid-induced neurotoxicity in vivo〔J〕.Eur J Neurosci,1999;11(1):83-90.

25Jenner P,Olanow CW.Oxidative stress and the pathogenesis of Parkinson′s disease〔J〕.Neurology,1996;47(6):S161-70.

26Xu PX,Wang SW,Yu XL,etal.Rutin improves spatial memory in Alzheimer′s disease transgenic mice by reducing Aβ oligomer level and attenuating oxidative stress and neuroinflammation〔J〕.Behav Brain Res,2014;264(2):173-80.

〔2014-12-19修回〕

(編輯徐杰)

通訊作者：張秀麗(1974-)，女，副教授，主要從事事神經(jīng)生物學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家自然基金(81102828,81273037,81341116)，山東省自然基金(ZR2011HM011)；山東省高等學(xué)校科技計劃項(xiàng)目(J11LF-86)，山東省衛(wèi)生科技發(fā)展項(xiàng)目(HW004)

中圖分類號〔〕R964〔

文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6685-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.018