Notch-1下調(diào)對(duì)雙氫青蒿素抗人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS存活率的影響*

齊　磊，　段永剛,△，　丁英奇，　張　龍，　劉玉章，　唐曉龍，　伍　驥

(1陜西省中醫(yī)醫(yī)院骨科，陜西 西安 710003； 2河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨外科，河北 張家口 075100； 3中國人民解放軍空軍總醫(yī)院骨科，北京 100142)

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Notch-1下調(diào)對(duì)雙氫青蒿素抗人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS存活率的影響*

齊磊1，段永剛1,2△，丁英奇2，張龍2，劉玉章2，唐曉龍2，伍驥3

(1陜西省中醫(yī)醫(yī)院骨科，陜西 西安 710003；2河北北方學(xué)院附屬第二醫(yī)院骨外科，河北 張家口 075100；3中國人民解放軍空軍總醫(yī)院骨科，北京 100142)

[摘要]目的： 探討Notch-1下調(diào)對(duì)雙氫青蒿素抗人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS細(xì)胞存活率的影響及其作用機(jī)制。方法: 雙氫青蒿素(5、10、15和20 μmol/L)孵育U-2OS細(xì)胞后，采用免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)骨肉瘤細(xì)胞中Notch-1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和Notch-1通路下游基因Hes-1的蛋白和mRNA的表達(dá)水平。下調(diào)Notch-1表達(dá)后，采用MTT法、免疫印跡法和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在雙氫青蒿素作用下U-2OS細(xì)胞的存活率，MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)以及U-2OS細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果: 免疫印跡法與逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示雙氫青蒿素呈劑量依賴性降低U-2OS細(xì)胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白和mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)；下調(diào)Notch-1表達(dá)后，增強(qiáng)了雙氫青蒿素抑制U-2OS細(xì)胞生長的作用，MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)及細(xì)胞遷移能力進(jìn)一步降低，顯著低于加藥組(P<0.05)。結(jié)論: 雙氫青蒿素可抑制U-2OS細(xì)胞中Notch-1通路的活性；下調(diào)Notch-1的表達(dá)可增強(qiáng)雙氫青蒿素抗骨肉瘤的作用。

[關(guān)鍵詞]Notch-1； 雙氫青蒿素； 人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS； 細(xì)胞存活率

骨肉瘤是一種多發(fā)病于兒童，成人常見，非血液性的惡性腫瘤，尤其在兒童中具有很高的發(fā)病率。其顯著特點(diǎn)是具有較高的肺轉(zhuǎn)移率(約為 10%～20%)和復(fù)發(fā)率。目前，骨肉瘤的臨床治療仍存在一定的困難，如化療藥物的毒副作用、耐藥性的出現(xiàn)、病情復(fù)發(fā)及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移肺部等。通過化療或手術(shù)治療后，獲得痊愈的患者也很少。隨著以手術(shù)為主，化療以及區(qū)域性介入化療為輔，聯(lián)合放療、基因、免疫、生物、中藥治療等多程式的治療方案的出現(xiàn)，使患者5年生存率大大提高，由20%升至60%～70%[1]。研究顯示，Notch-1信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖、分化中起重要作用[2]。有研究報(bào)道指出，Notch-1分子在胰腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌以及骨肉瘤等多種癌癥細(xì)胞組織中呈高表達(dá)[3-4]，且在骨肉瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。抑制骨肉瘤細(xì)胞中Notch-1信號(hào)通路，其侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯降低[5]。已知基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與Notch-1信號(hào)之間存在相互作用，而Hes-1為Notch-1通路的下游信號(hào)分子，在體內(nèi)外抑制多種細(xì)胞的發(fā)育分化，Notch-1通路在多種細(xì)胞中主要通過Hes-1發(fā)揮作用。

青蒿素是一種含過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，具有多種衍生物[6]。對(duì)瘧原蟲有強(qiáng)大且迅速的殺滅作用，被推薦為以青蒿素為主體的聯(lián)合治療，對(duì)抗瘧疾取得良好的效果。青蒿素類藥物被人體吸收后，主要轉(zhuǎn)化為雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)來發(fā)揮藥理作用。雙氫青蒿素以其高效、低毒的抗瘧疾作用，除被廣泛應(yīng)用于治療瘧疾外，近十多年來發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素還具有抗腫瘤、治療血吸蟲病、提高生物體免疫力等功效。已有研究表明雙氫青蒿素能有效地抑制人骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲，且能促進(jìn)其凋亡，能明顯地抑制人骨肉瘤細(xì)胞生存活力和克隆形成[7]。劉朝霞等[8]研究發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素能抑制卵巢癌Skov3細(xì)胞的增殖，能夠下調(diào)Skov3細(xì)胞中的Notch的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過下調(diào)Notch1信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。但尚未有雙氫青蒿素在骨肉瘤方面的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究Notch-1通路對(duì)雙氫青蒿素抗人骨肉瘤細(xì)胞株U-2OS細(xì)胞的影響，探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1材料與試劑

人肉骨瘤U-2OS細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所；RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基購于美國Life Technologies；LipofectamineTM2000，SYBR Green qPCR試劑盒購于Invitrogen；靶向Notch-1基因的2對(duì)siRNA寡核苷酸(S1和S2)購于Ambion, S1正義鏈為5’-GAUUCUGAUUCGCCAACCGATT-3’，反義鏈5’-UCGGUUGCGAAUCAGAAUCTG -3’；S2正義鏈為5’-GAUGUAACAUUGACAUUGATT-3’，反義鏈5’-UCAAUGUCAAUGUUACAUCTC-3’；Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1抗體購于Santa Cruz；雙氫青蒿素購于南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司；MTT試劑購于Sigma；Transfer小室購于Chemicon；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2細(xì)胞培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)分組及其干預(yù)

將人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞株置于含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d用0.25%胰酶消化傳代1次。

本實(shí)驗(yàn)按下列兩種情況分組：(1)分為空白對(duì)照(control，Con)組和不同濃度(5、10、15和20 μmol/L)雙氫青蒿素溶液孵育U-2OS細(xì)胞24 h組。(2)分5組：空白對(duì)照組；DHA組；陰性對(duì)照(NC+DHA)組，加入非特異性siRNA；S1+ DHA和S2+ DHA組，分別加入轉(zhuǎn)染了靶向Notch-1基因的兩對(duì)siRNA序列S1和S2，轉(zhuǎn)染結(jié)束后，向除空白組外的細(xì)胞中加入15 μmol/L雙氫青蒿素溶液分別孵育12 h、24 h、36 h和48 h。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染按LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行操作。取對(duì)數(shù)生長期的U-2OS細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，采用血球計(jì)數(shù)板技術(shù)，加入RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L。取2 mL接種于6孔板，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%左右，將2組siRNA溶于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入LipofectamineTM2000，輕輕混合均勻，室溫靜置30 min，形成復(fù)合體后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 h后去掉轉(zhuǎn)染液，改用正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。以同樣方式轉(zhuǎn)染空載體與非特異性siRNA。

3.2Western blotting法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平取各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，提取細(xì)胞蛋白并定量。取適量裂解產(chǎn)物，以1∶4比例加入樣品與緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng) I 抗于4 ℃孵育4 h，TBST洗滌20 min；加入相應(yīng) II 抗于室溫孵育1 h，TBST洗滌20 min；顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

3.3Real-time PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平按TRIzol說明書提取總RNA，催化逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，運(yùn)用SYBR Green qPCR試劑盒，檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。反應(yīng)條件為 95 ℃ 30 s；60 ℃ 90 s， 64 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

表1　引物序列

F: forward; R: reverse.

3.4MTT法檢測(cè)U-2OS細(xì)胞存活率選擇處于對(duì)數(shù)生長期的U-2OS細(xì)胞，制備為細(xì)胞懸液，接種于96孔板，調(diào)整使得密度每孔5×103個(gè)，分別于12 h、24 h、36 h和48 h加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于488 nm處檢測(cè)吸光度值，并計(jì)算存活率，存活率(%)=(加藥孔吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值)×100%。

3.5下調(diào)Notch-1表達(dá)后，檢測(cè)U-2OS細(xì)胞的遷移能力將細(xì)胞置于無血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，稀釋濃度為1×108/L；每Transwell小室的上室加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入300 μL完全培養(yǎng)基，孵育24 h。生理鹽水漂洗，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下拍照，選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)對(duì)兩兩樣本間均數(shù)進(jìn)行比較；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1雙氫青蒿素抑制U-2OS細(xì)胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)

DHA組中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)降低，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示雙氫青蒿素能抑制U-2OS細(xì)胞中Notch-1信號(hào)通路的活性，且其抑制作用具有劑量依賴性，見圖1。

Figure 1.The effects of dihydroartemisinin on the protein expression of Notch1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 in U-2OS cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖1U-2OS細(xì)胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)

2雙氫青蒿素抑制U-2OS細(xì)胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的mRNA表達(dá)

U-2OS細(xì)胞經(jīng)過5、10、15和20 μmol/L雙氫青蒿素溶液孵育24 h后，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見表2，結(jié)果與免疫印跡法一致，提示雙氫青蒿素呈劑量依賴性抑制Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的mRNA表達(dá)，表明雙氫青蒿素的抗骨肉瘤作用與Notch-1通路有關(guān)。

表2U-2OS細(xì)胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1 mRNA的表達(dá)

Table 2.The effects of dihydroartemisinin on the mRNA expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 in U-2OS cells (Mean±SD.n=6)

DHA(μmol/L)Notch-1MMP-2MMP-9Hes-101.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.0050.78±0.05*0.81±0.06*0.83±0.04*0.85±0.05*100.49±0.03*0.42±0.04*0.50±0.03*0.45±0.04*150.22±0.02*0.19±0.02*0.24±0.02*0.18±0.02*200.21±0.02*0.20±0.01*0.23±0.02*0.17±0.02*

*P<0.05vs0 μmol/L.

3MTT法測(cè)定U-2OS細(xì)胞存活率

下調(diào)Notch-1的表達(dá)后，15 μmol/L雙氫青蒿素溶液孵育U-2OS細(xì)胞，并采用MTT法在各時(shí)點(diǎn)處檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示48 h后，DHA組的存活率顯著低于空白對(duì)照組，而S1與S2轉(zhuǎn)染組的存活率進(jìn)一步降低(P<0.05)。加藥組與陰性對(duì)照組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。這提示下調(diào)Notch-1表達(dá)可增加雙氫青蒿素對(duì)U-2OS細(xì)胞活力的抑制作用。

Figure 2.Knockdown ofNotch-1 augmented dihydroartemisinin-induced decrease in viability of U-2OS cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDHA group.

圖2下調(diào)Notch-1的表達(dá)對(duì)雙氫青蒿素抑制U-2OS細(xì)胞存活率的影響

4下調(diào)Notch-1表達(dá)后U-2OS細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)

在雙青蒿素(15 μmol/L)下調(diào)MMP-2、MMP-9和Hes-1的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步下調(diào)Notch-1表達(dá)，并以15 μmol/L雙氫青蒿素溶液孵育細(xì)胞24 h后，觀察以上蛋白的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)S1和S2轉(zhuǎn)染組的U-2OS細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)與DHA組相比顯著降低(P<0.05)，而DHA組與陰性對(duì)照組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3，提示下調(diào)Notch-1表達(dá)可進(jìn)一步降低MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)水平。

Figure 3.Knockdown ofNotch-1 enhanced dihydroartemisinin-induced decrease in the protein expression of MMP-2, MMP-9 and Hes-1 in U-2OS cells. Mean±SD. n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDHA group.

圖3下調(diào)Notch-1表達(dá)對(duì)U-2OS細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和Hes-1蛋白表達(dá)的影響

5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，15 μmol/L雙氫青蒿素孵育U-2OS細(xì)胞24 h后，細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(P<0.05)；在此基礎(chǔ)上下調(diào)Notch-1表達(dá)后，S1和S2轉(zhuǎn)染組中細(xì)胞的遷移數(shù)與DHA組相比顯著減少(P<0.05)。DHA組與陰性對(duì)照組相比細(xì)胞遷移數(shù)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。結(jié)果表明下調(diào)Notch-1表達(dá)能增強(qiáng)雙氫青蒿素抑制U-2OS細(xì)胞遷移的能力。

Figure 4.The effect ofNotch-1 knockdown on the cell migration in the presence of dihydroartemisinin (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsDHA group.

圖4下調(diào)Notch-1表達(dá)后的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討論

骨肉瘤為骨外科中常見的好發(fā)于兒童和青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有早期遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和高度局部復(fù)發(fā)傾向[7]。盡管近年來以外科手術(shù)輔助化療的治療措施上取得了較大進(jìn)展，但患者的死亡率仍居高不下，最主要原因之一就是骨肉瘤很容易復(fù)發(fā)并迅速轉(zhuǎn)移。目前臨床上用于治療骨肉瘤的藥物大多毒副作用大，療效較差[10]。因此，近年來尋覓一種新的安全有效的治療方法成為骨肉瘤治療的研究熱點(diǎn)之一，對(duì)于提高患者的生存具有非常重要的意義。

青蒿素的早期研究主要是針對(duì)其高效的抗瘧疾活性。多種青蒿素衍生物中以雙氫青蒿素的水溶性良好，毒副作用最小。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素在抗腫瘤活性方面具有療效強(qiáng)，且對(duì)正常組織細(xì)胞的毒性很低。Notch受體是一組高度保守的跨膜蛋白，與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡具有密切關(guān)系。研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶與Notch-1通路的信號(hào)有關(guān)，MMPs是一類鋅依賴性的蛋白水解酶，與腫瘤遷移轉(zhuǎn)移及血管重塑密切相關(guān)，MMP-2與MMP-9是家族中的一員[8, 11-12]。Hes-1作為Notch-1通路下游的靶基因，在Notch-1通路中起重要作用。本研究通過采用siRNA轉(zhuǎn)染人骨肉瘤U-2OS細(xì)胞，探討雙氫青蒿素抗骨肉瘤的作用及其相關(guān)機(jī)制。免疫印跡法和real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明雙氫青蒿素呈濃度依賴性抑制U-2OS細(xì)胞中Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白和mRNA的表達(dá)。提示雙氫青蒿素抗骨肉瘤作用與Notch-1通路的活性有關(guān)。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在15 μmol/L與20 μmol/L的雙氫青蒿素作用下，Notch-1、MMP-2、MMP-9和Hes-1的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)沒有明顯差異，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用15 μmol/L的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。下調(diào)Notch-1的表達(dá)后，MTT法檢測(cè)結(jié)果表明雙氫青蒿素能顯著抑制U-2OS細(xì)胞的生長，表明下調(diào)Notch-1能增強(qiáng)雙氫青蒿素抑制U-2OS細(xì)胞的生長能力。另通過免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA并采用雙氫青蒿素孵育24 h后，U-2OS細(xì)胞中MMP-2、MMP9和Hes-1的蛋白表達(dá)水平明顯降低，與加藥組相比具有顯著差異。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)Notch-1表達(dá)后，雙氫青蒿素對(duì)U-2OS細(xì)胞活力的抑制作用增強(qiáng)，以及抗骨肉瘤作用也增強(qiáng)。再者，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證明，下調(diào)Notch-1表達(dá)后，在雙氫青蒿素作用下，U-2OS細(xì)胞的遷移能力明顯減弱。

綜上所述，雙氫青蒿素抗骨肉瘤的作用機(jī)制與Notch-1通路密切相關(guān)，提示下調(diào)Notch-1的表達(dá)可增強(qiáng)雙氫青蒿素的抗骨肉瘤作用。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81173372; No. 81101797)

Knockdown ofNotch-1 augments inhibitory effect of dihydroartemisinin on viability of human osteosarcoma cell line U-2OSQI Lei1, DUAN Yong-gang1, 2, DING Ying-qi2, ZHANG Long2, LIU Yu-zhang2, TANG Xiao-long2, WU Ji3

(1DepartmentofOrthopedics,ShanxiProvinceHospitalofTCM,Xi’an710003,China;2DepartmentofOrthopedicSurgery,TheSecondHospitalAffiliatedtoHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075100,China;3DepartmentofOrthopedics,AirForceGeneralHospitalofPLA,Beijing100142,China.E-mail:drduanyonggang@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effect of Notch-1 knockdown on the growth of dihydroartemisinin-inhibited human osteosarcoma cell line U-2OS. METHODS: U-2OS cells treated with different concentrations of dihydroartemisinin (5, 10, 15 and 20 μmol/L) were collected. The expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 at mRNA and protein levels was measured by real-time PCR and Western blotting, respectively. U-2OS cells were transfected with Notch-1 siRNA for 24 h and incubated with dihydroartemisinin for another 24 h. The cell apoptotic rate, protein expression of MMP-2, MMP-9 and Hes-1, and the migration ability were measured by MTT assay, Western blotting and Transwell experiment, respectively. RESULTS: Dihydroartemisinin (5, 10, 15 and 20 μmol/L) decreased the expression of Notch-1, MMP-2, MMP-9 and Hes-1 at mRNA and protein levels in a dose-dependent manner. Down-regulation of Notch-1 significantly enhanced the effect of dihydroartemisinin on the cell apoptosis, the protein expression of MMP-2, MMP-9 and Hes-1, and migration ability (P<0.05). CONCLUSION: Notch-1 pathway is involved in the process of dihydroartemisinin-inhibited U-2OS cell growth. Knockdown of Notch-1 augments the inhibitory effect of dihydroartemisinin on U-2OS cell viability.

[KEY WORDS]Notch-1; Dihydroartemisinin; Human osteosarcoma cell line U-2OS; Cell viability

通訊作者△Tel: 0377-61660213; E-mail：huishuang1976@163.com

[收稿日期]2015- 05- 12[修回日期] 2015- 09- 24

[文章編號(hào)]1000- 4718(2015)12- 2126- 04

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.002

[中圖分類號(hào)]R362

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A