柱前衍生/高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定面粉制品中的偶氮甲酰胺

章建輝，歐陽(yáng)麗，彭新凱，夏立新，李　歡，汪　輝

(1.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南　長(zhǎng)沙　410013；2.湖南澄源檢測(cè)有限公司，湖南　長(zhǎng)沙　410000)

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柱前衍生/高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定面粉制品中的偶氮甲酰胺

章建輝1,2*，歐陽(yáng)麗1，彭新凱1，夏立新1，李歡1，汪輝1

(1.長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南長(zhǎng)沙410013；2.湖南澄源檢測(cè)有限公司，湖南長(zhǎng)沙410000)

摘要：建立了面粉制品中偶氮甲酰胺(ADA)殘留量的丹磺酰氯柱前衍生結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)器的分析方法。面粉制品中的ADA經(jīng)濕熱處理后，轉(zhuǎn)變成氨基脲(SEM)，加入丹磺酰氯(DNS-Cl)進(jìn)行衍生。采用Aglient TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行分離，流動(dòng)相為乙腈-水(65∶35)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。偶氮甲酰胺在0.1～50 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.998，檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)分別為0.03 mg/L和0.10 mg/L。在0.1，0.3，1.0 mg/kg 3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為78.4%～96.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)為7.1%～9.4%。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等特點(diǎn)，可用于面粉制品中偶氮甲酰胺的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：柱前衍生；高效液相色譜-熒光檢測(cè)器；偶氮甲酰胺；丹磺酰氯

偶氮甲酰胺(Azodicarbonamide,ADA)又名偶氮二酰胺，為黃至橘紅色結(jié)晶性粉末,具有漂白和氧化雙重作用,是工業(yè)中常用的發(fā)泡劑。偶氮甲酰胺也作為漂白劑和改良劑在面粉中使用，GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定小麥粉中偶氮甲酰胺的最大用量為45 mg/kg[1]。研究表明，偶氮甲酰胺在濕熱條件下分解產(chǎn)生聯(lián)二脲(Biurea,HDC)，聯(lián)二脲在高溫條件下又能轉(zhuǎn)變成氨基脲(Semicarbazide,SEM)[2]，然而氨基脲具有致突變和致癌作用。近年來(lái)，大量研究表明，由于偶氮甲酰胺全部降解生成聯(lián)二脲與氨基脲[3-5]，故在面粉制品中不能檢出。因此，有必要建立面粉制品中偶氮甲酰胺的最終代謝產(chǎn)物氨基脲的檢測(cè)方法，并通過(guò)氨基脲的含量來(lái)評(píng)估面粉中偶氮甲酰胺的使用量。

目前，有關(guān)偶氮甲酰胺及其代謝物聯(lián)二脲和氨基脲的檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[8-11]，其中HPLC法具有簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，但提取困難、操作繁瑣、響應(yīng)低、干擾多；LC-MS/MS法靈敏度高、專一性強(qiáng)，但儀器價(jià)格昂貴；因此開發(fā)一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的檢測(cè)方法非常重要。丹磺酰氯作為液相色譜柱前衍生試劑具有衍生操作簡(jiǎn)單、衍生物穩(wěn)定性好、熒光吸收強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)范圍寬、基體干擾不明顯等優(yōu)點(diǎn)[12]，在胺類化合物分析中應(yīng)用廣泛[13-14]，此衍生方法在面粉制品中偶氮甲酰胺的檢測(cè)方面尚未見報(bào)道。本文采用丹磺酰氯與偶氮甲酰胺代謝物氨基脲進(jìn)行衍生反應(yīng)，高效液相色譜-熒光檢測(cè)器進(jìn)行分離測(cè)定，對(duì)面粉制品中偶氮甲酰胺代謝物氨基脲進(jìn)行檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定，可進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀，配自動(dòng)進(jìn)樣器和熒光檢測(cè)器(日本島津公司)；CT14D型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司)；SK-1型快速混勻器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠)；A10型超純水處理器(美國(guó)Millipore公司)。

乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；正己烷、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、氯化氫、冰醋酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；偶氮甲酰胺(含量>97.0%，上海沃凱化學(xué)試劑有限公司)；丹磺酰氯(含量>98.0%，日本東京化成工業(yè))；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取10 mg(精確至0.001 mg)偶氮甲酰胺，用25 mL 0.5 mol/L 鹽酸于60 ℃水解4 h，冷卻后用 0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)至中性,加水定容至100 mL配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冷藏保存；使用時(shí)用水逐級(jí)稀釋成所需濃度的工作液。

1.3樣品的提取與凈化

精確稱取1.0 g樣品于15 mL塑料離心管中，加4 mL 0.5 mol/L鹽酸渦旋混勻，60 ℃水浴水解4 h,冷卻后用0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)至近中性，分別加入1 mL亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液，定容至10 mL后加1 mL正己烷渦旋混勻。5 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，取1 mL上清液衍生。

1.4樣品衍生

取1 mL待衍生液置于15 mL塑料離心管中，加入1 mL 0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖溶液(pH 9.5)與1 mL 3.0 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液，渦旋混勻，避光下50 ℃水浴衍生45 min。5 000 r/min離心3 min，將上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)相濾膜后上液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)。

1.5色譜條件

色譜柱：Agilent TC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：水-乙腈溶液(35∶65)，進(jìn)樣量10 μL；激發(fā)波長(zhǎng)330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

2結(jié)果與討論

2.1樣品的提取與凈化

面粉制品中添加的偶氮甲酰胺經(jīng)過(guò)高溫、高濕環(huán)境后，將分解為聯(lián)二脲和氨基脲，采用純水提取時(shí)，只能得到基質(zhì)中的氨基脲[3]。本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)方法[9，11]，采用4 mL 0.5 mol/L鹽酸于60 ℃水浴4 h對(duì)樣品進(jìn)行水解，該條件下面粉制品中的偶氮甲酰胺和聯(lián)二脲全部轉(zhuǎn)化為氨基脲。為保證檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)結(jié)果的可靠性，需去除水解后面粉制品中含有的脂肪和蛋白成分。面粉制品經(jīng)鹽酸水解后，以0.5 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液至中性，再加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白；然后加入正己烷脫脂，5 000 r/min離心5 min后棄去正己烷層。

2.2流動(dòng)相的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究[15]，考察了乙腈-水和乙腈-0.01 mol/L乙酸鈉(乙酸調(diào)至pH 4.2)分別作為流動(dòng)相時(shí)衍生產(chǎn)物與雜質(zhì)峰色譜分離的情況。結(jié)果顯示，提高流動(dòng)相中乙腈的比例可以加快分離過(guò)程，但乙腈比例過(guò)高時(shí)，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰無(wú)法基線分離，干擾檢測(cè)。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈和水的體積比為65∶35時(shí)，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰的分離度為1.8，保留時(shí)間為8.354 min，分析時(shí)間較短。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈和0.01 mol/L乙酸鈉的體積比為65∶35時(shí)，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰也能得到良好分離，但保留時(shí)間變長(zhǎng)(10.50 min)。此外，乙腈-0.01 mol/L乙酸鈉流動(dòng)相的配制繁瑣，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-水(65∶35)作為流動(dòng)相。

圖1　pH值對(duì)偶氮甲酰胺峰面積的影響Fig.1　Effect of reaction pH value on peak area of ADA(50 mg/L)

圖2　衍生反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)偶氮甲酰胺峰面積的影響Fig.2　Effect of derivative reaction temperature and time on peak area of ADA(50 mg/L)

2.3衍生條件的優(yōu)化

2.3.1衍生溶劑的pH值反應(yīng)介質(zhì)的pH值對(duì)氨基脲衍生反應(yīng)的影響很大。實(shí)驗(yàn)考察了0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖溶液的pH值分別為8.5，9.0，9.2，9.5，10.0，10.5，11.0時(shí)衍生產(chǎn)物的峰面積，結(jié)果見圖1。由圖可知：隨著pH值的逐漸增大，衍生產(chǎn)物丹磺酰-氨基脲產(chǎn)量先增加后減小，在pH值為9.5時(shí)，衍生物的生成量最大。因此實(shí)驗(yàn)選取pH 9.5的 0.1 mol/L 碳酸氫鈉緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì)。

2.3.2衍生溶劑的濃度根據(jù)衍生反應(yīng)的比例關(guān)系及衍生劑需適當(dāng)過(guò)量的原則，在系列15 mL離心管中加入1 mL 50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品后，再加入1 mL濃度為1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mg/mL的丹磺酰氯乙腈溶液進(jìn)行衍生反應(yīng)。結(jié)果顯示：隨著丹磺酰氯濃度的增大，其衍生物產(chǎn)量增多，當(dāng)加入3.0 mg/mL丹磺酰氯時(shí)，衍生物產(chǎn)量達(dá)到穩(wěn)定值；但丹磺酰氯的濃度大于3.0 mg/mL時(shí)，衍生反應(yīng)溶液會(huì)出現(xiàn)渾濁，產(chǎn)生不溶性的黃色物質(zhì)。為節(jié)約成本，實(shí)驗(yàn)選取3.0 mg/mL丹磺酰氯乙腈溶液為衍生溶劑。

2.3.3衍生反應(yīng)溫度與時(shí)間的選擇考察了不同溫度和時(shí)間對(duì)衍生物產(chǎn)率的影響(見圖2)。結(jié)果表明：衍生溫度為50 ℃，時(shí)間為 45 min時(shí)衍生物的生成量最大。對(duì)比考察了室溫避光過(guò)夜衍生和50 ℃衍生 45 min的結(jié)果，2種衍生條件下衍生物的生成量未見明顯增加。由于溫度過(guò)高或衍生時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，均會(huì)導(dǎo)致衍生副反應(yīng)過(guò)多，而室溫避光隔夜的衍生時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因此實(shí)驗(yàn)選取50 ℃水浴45 min作為衍生條件。

2.4穩(wěn)定性考察

取相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品加標(biāo)溶液，分別放置0，5，10，15，24，36 h后進(jìn)行測(cè)定，待測(cè)組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.3%和4.1%，表明衍生物在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5線性范圍、檢出限與定量下限

分別吸取一定體積的偶氮甲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為0，0.1，0.5，1.0，10.0，20.0，50.0 mg/L的系列偶氮甲酰胺工作液，取1 mL按照“1.4”方法進(jìn)行衍生，“1.5”方法進(jìn)行色譜分析。以質(zhì)量濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)求得線性回歸方程為Y=1 659.8X+3 691.7，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.998。以信噪比S/N≥3及S/N≥10分別確定方法的檢出限為0.03 mg/L，定量下限為0.10 mg/L。

2.6回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

選取不含偶氮甲酰胺的面粉制品作為基質(zhì)，進(jìn)行0.1，0.3，1.0 mg/kg 3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，同一加標(biāo)水平平行測(cè)定6次，其平均回收率分別為78.4%，85.7%，96.6%，RSD分別為9.4%，7.1%及7.5%。相關(guān)色譜圖見圖3。

2.7與其他方法的比較

與相關(guān)文獻(xiàn)方法進(jìn)行比較，本方法的定量下限(LOQ=0.10 mg/L)介于HPLC(LOQ=1.0 mg/kg)[6]和HPLC-MS/MS(LOQ=0.000 5 mg/kg)[11]兩者之間，說(shuō)明本方法靈敏度高，具有很高的準(zhǔn)確性。

2.8實(shí)際樣品的檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)市購(gòu)10個(gè)不同類型面粉制品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，4個(gè)樣品中檢出偶氮甲酰胺，其含量為1.06～18.4 mg/kg，該含量小于國(guó)家規(guī)定的偶氮甲酰胺在面粉中的最大殘留限量。

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Determination of Azodicarbonamide in Flour Products by High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector Coupled with Precolumn DerivatizationZHANG Jian-hui1，2*，OUYANG Li1，PENG Xin-kai1，XIA Li-xin1,LI Huan1,WANG Hui1

(1.Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety,Changsha410013,China；2.Hunan

Chengyuan Testing Corporation Limited,Changsha410000,China)

Abstract：A method was developed for the determination of azodicarbonamide(ADA) in flour products using dansyl chloride(DNS-Cl) precolumn derivatization combined with high performance liquid chromatography-fluorescence detector.ADA in flour products was hydrolyzed by wet heat processing and formed semicarbazide(SEM) finally.SEM was derivatized with DNS-Cl.The derivatization product was separated on an Aglient TC C18column(250 mm× 4.6 mm,5 μm) using acetonitrile-water(65∶35) as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The oven temperature was set at 30 ℃，the excitation wavelength was 330 nm and the detection wavelength was 530 nm.Under the optimal conditions,the linear range for ADA was in the range of 0.1-50 mg/L with correlation coefficient(r) higher than 0.998.The limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ) for the method were 0.03 mg/L and 0.10 mg/L,respectively.The spiked recoveries of ADA at three levels of 0.1,0.3,1.0 mg/kg ranged from 78.4%to 96.6%with RSDs of 7.1%-9.4%.With advantages of simplicity,rapidness and sensitivivity,the method was successfully applied in the analysis of ADA in flour products.

Key words：precolumn derivatization；high performance liquid chromatography-fluorescence detector；azodicarbonamide(ADA)；dansyl chloride

中圖分類號(hào)：O657.72;TQ314.259

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-4957(2015)12-1430-04

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.018

通訊作者：*章建輝，碩士，工程師，研究方向：食品與環(huán)境分析，Tel:0731-88635360,E-mail:zhangjianhui2012@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201310130)

收稿日期：2015-05-11；修回日期：2015-06-02