抗結(jié)核固定劑量復(fù)合劑微生物限度檢查方法的建立和驗(yàn)證

陳 娟

抗結(jié)核固定劑量復(fù)合劑微生物限度檢查方法的建立和驗(yàn)證

陳 娟

【摘要】目的 探討抗結(jié)核固定劑量復(fù)合劑的微生物限度檢查方法的建立。方法 按照《中國藥典》2010年版附錄X ⅢC進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 抗結(jié)核固定劑量復(fù)合劑對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、大腸埃希菌有一定的抑制作用。結(jié)論 抗結(jié)核固定劑量復(fù)合劑對細(xì)菌的計(jì)數(shù)方法應(yīng)為離心沉淀法-薄膜過濾法，常規(guī)法進(jìn)行霉菌（酵母菌）計(jì)數(shù)檢驗(yàn)，薄膜過濾法進(jìn)行控制菌檢驗(yàn)。

【關(guān)鍵詞】驗(yàn)證試驗(yàn)；抗結(jié)核固定劑量復(fù)合劑；離心沉淀集菌-薄膜過濾法；常規(guī)法

【中圖分類號】R978.3;R927.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號】1673-5846(2015)10-0023-04

【Abstract】Objective To set up a method for microbial limit of Rifampin and Isoniazid Tablets.Methods Validation of microbial limit tests according to Chinese Pharmacopoeia edition 2010.Results FDCs has very strong inhibiting effect on Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis and Candida albicans.Conclusion Low speed centrifuge-filtration methods were used with take count of bacterium;General methods were used with take count of mold and yeasts of FDCs.Pathogenic bacteria can be tested when filtration methods were used.

貴州省畢節(jié)市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州畢節(jié) 551700

Establishment and Validation of Microbial Limit Method for Anti-tuberculosis Fixed Dose Combinations

Chen Juan

【Key Words】Validation;FDCs;Filtration method;General method

世界衛(wèi)生組織為遏制全球結(jié)核病的威脅，主張使用抗結(jié)核藥物的固定劑量復(fù)合劑（FDCs）代替抗結(jié)核單藥制劑來治療結(jié)核病患者。使用FDCs可以提高單一化療效果，減少耐藥菌的產(chǎn)生，根據(jù)患者服藥劑量，無需詳細(xì)計(jì)算藥物劑量，以簡便處方和服用。因?yàn)镕DCs中的利福平有一定程度的抑菌作用，所以在對有抗菌活性的藥物進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，必須先消除其抗菌活性，通過試驗(yàn)驗(yàn)證抗菌活性去除是否徹底，保證檢驗(yàn)結(jié)果的有效性。為了消除FDCs的抗菌活性，真實(shí)地反映該藥物所污染微生物的程度，參考《中國藥典》[1]和研究資料[2-4]對FDCs進(jìn)行微生物限度檢驗(yàn)方法驗(yàn)證。本試驗(yàn)采用2010年版中國藥典規(guī)定的3株細(xì)菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌）、2株真菌（黑曲霉菌、白色念珠菌），采用常規(guī)法和低速離心-薄膜過濾法分別對3批利福平異煙肼片、乙胺利福異煙片、乙胺吡嗪利福異煙片進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)和控制菌進(jìn)行方法驗(yàn)證，建立適合于FDCs的微生物限度檢查方法。

1　儀器與材料

1.1 試驗(yàn)儀器 GHP-9000型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；HC-TP-12型架盤天平（天津市天平儀器有限公司）；LMQ.C型立式壓力蒸汽滅菌鍋（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；TG16-WS型臺式離心沉淀器（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SHA-C型電熱恒溫振蕩器（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司）；DLM型鼓風(fēng)干燥箱（常州創(chuàng)威實(shí)驗(yàn)儀器廠）；薄膜過濾器（畢節(jié)市食品藥品檢驗(yàn)所）。

1.2 試驗(yàn)材料 異福片（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1009011、1009021、1009031）；利福平異煙肼片（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1009011、1009021、1009031）；乙胺吡嗪利福異煙片（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1009011、1009021、1009031）；大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC （B）44102]；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]；枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]；菌種來源（中國藥品生物制品檢定所提供，各菌株均為第3代）。

1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂（島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號：20131121）；改良馬丁培養(yǎng)基（島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號：20120907）；膽鹽乳糖培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：111006）；玫瑰紅鈉瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：110109）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：121024）；MUG培養(yǎng)基

（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：110212），按照《中國藥典》2010年版規(guī)定配制及滅菌。

2　試驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備 取供試品10 g，加入200 ml 的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，置40 ℃水浴中溶化，振搖，制成1:10的供試品溶液。

2.2 菌液制備 ①取經(jīng)35 ℃培養(yǎng)24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌的肉湯培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含細(xì)菌數(shù)為10～100 cfu的菌懸液，做活菌技術(shù)用。②取培養(yǎng)48 h的白色念珠菌至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1 ml含細(xì)菌數(shù)為10～100 cfu的菌懸液，做活菌技術(shù)用。③接種預(yù)先活化的黑曲霉菌種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1 ml含細(xì)菌數(shù)為10～100 cfu的菌懸液，做活菌技術(shù)用。

2.3 驗(yàn)證步驟

2.3.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法

2.3.1.1 常規(guī)法 ①供試品對照組：取靜置15 min 的1:10的供試液1 ml，測定供試品的本底菌數(shù)。②試驗(yàn)組：供試液放置15 min后，取1 ml注入一平皿中，然后再取含細(xì)菌數(shù)為10～100 cfu的試驗(yàn)菌液1 ml，立即傾注20 ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測定菌落數(shù)。③稀釋劑對照組：分別取10～100 cfu的試驗(yàn)菌和稀釋劑各1 ml，按試驗(yàn)組菌數(shù)測定方法測定菌數(shù)。④菌液組：測定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

2.3.1.2 離心沉淀集菌+薄膜過濾法 取靜置15 min 后1:20的供試液的上清液10 ml，經(jīng)500轉(zhuǎn)3 min離心后，吸取5 ml（菌種的回收率能達(dá)到70%以上），然后再加入100 ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液混勻，通過濾膜，用500 ml的上述緩沖液分次沖洗，每次80 ml，最后在沖洗液中加入試驗(yàn)菌，過濾，將濾膜貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定菌數(shù)。①供試品對照組：測定供試品本底菌數(shù)。②試驗(yàn)組：取離心后的上清液適量，按上述方法測定試驗(yàn)組菌數(shù)。③稀釋劑對照組：取供試品對照組供試液等量的稀釋劑和10～100 cfu試驗(yàn)菌，按試驗(yàn)組的菌數(shù)測定方法測定菌數(shù)。④菌液組：主要測定試驗(yàn)中所加入的菌數(shù)是否合適。

2.3.2 驗(yàn)證控制菌的檢查方法 菌液的制備：將活化好的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌菌種接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，24 h后將上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1 ml含10～100 cfu的菌懸液。

2.3.2.1 常規(guī)法 ①陰性菌對照組：取靜置15 min后供試液（1:20）10 ml，加入100 ml LBL增菌培養(yǎng)基中，然后再加入金黃色葡萄球菌試驗(yàn)菌，搖勻，按照控制菌檢查法檢查。②試驗(yàn)組：取靜置15 min后供試液（1:20）10 ml及大腸埃希菌的試驗(yàn)菌入100 ml LBL增菌培養(yǎng)基中，混勻，依照控制菌法檢查。

2.3.2.2 薄膜過濾法 ①陰性菌對照組：供試液靜置15 min后，取上清液10 ml于50 ml pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中搖勻，過濾，用上述溶液500 ml分次沖洗濾膜，每次50 ml，最后在沖洗液中加入上述金黃色葡萄球菌，取出濾膜接入100 ml LBL增菌培養(yǎng)基中，按照大腸埃希菌法檢查。②試驗(yàn)組：供試液靜置15 min后，取上清液10 ml于100 ml pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中搖勻，過濾，用該溶液500 ml分次沖洗濾膜，每次50 ml，最后在沖洗液中加入上述大腸埃希菌，取出濾膜接入100 ml LBL增菌培養(yǎng)基中，按照大腸埃希菌法檢查。

2.4 結(jié)果及回收率測定判斷標(biāo)準(zhǔn)

3　結(jié)果

3.1 利福平異煙肼片試驗(yàn)結(jié)果 見表1～3。

3.2 乙胺利福異煙片試驗(yàn)結(jié)果 見表4～6。

3.3 乙胺吡嗪利福異煙片試驗(yàn)結(jié)果 見表7～9。

表1　利福平異煙肼片枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果

4　結(jié)論

通過試驗(yàn)結(jié)果可以看出，利福平異煙肼片、乙胺利福異煙片、乙胺吡嗪利福異煙片微生物限度檢查法，細(xì)菌計(jì)數(shù)可采用離心沉淀集菌+薄膜過濾法，且供試品的供試液終濃度為1:1000；霉菌（酵母菌）

計(jì)數(shù)可采用常規(guī)法；控制菌檢查可采用薄膜過濾法進(jìn)行檢驗(yàn)。

由于抗結(jié)核固定劑量復(fù)合劑具有很強(qiáng)的抑菌作用，在檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)排除其抑制作用，使其不干擾染菌限度檢查，結(jié)果才有效。

表2　常規(guī)法驗(yàn)證利福平異煙肼片白色念珠菌、黑曲霉的回收率(%)

表3　控制菌試驗(yàn)結(jié)果

表4　乙胺利福異煙片枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果

表5　常規(guī)法驗(yàn)證乙胺利福異煙片白色念珠菌、黑曲霉的回收率(%)

表6　控制菌常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果

表7　乙胺吡嗪利福異煙片枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌驗(yàn)證結(jié)果

表8　常規(guī)法驗(yàn)證乙胺吡嗪利福異煙片白色念珠菌、黑曲霉的回收率(%)

表9　控制菌常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果

參考文獻(xiàn)

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版[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2012:107-116.

[2] 中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:351-389.

[3] 劉鵬,馬仕洪,戴翠,等.加替沙星微生物限度檢查方法的建立[J].藥物分析雜志,2007,27(6):881-881.

[4] 馬緒榮.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2000: 289-290.