HPLC法與比色法分析柴胡中皂苷與黃酮類(lèi)成分動(dòng)態(tài)積累變化

王斌++張騰霄++喬秀麗等

摘要：為尋求柴胡生產(chǎn)的最佳采收期，采用HPLC法、亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法研究不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，隨著采收期的延后，柴胡根中皂苷、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量都是先下降后上升再下降，且9月1日采收的柴胡中皂苷、黃酮含量都比較高。柴胡最佳采收期確定還應(yīng)結(jié)合其他主要有效成分含量動(dòng)態(tài)積累的規(guī)律。該試驗(yàn)方法簡(jiǎn)便、快速、可靠。

關(guān)鍵詞：柴胡；皂苷；黃酮；采收期；動(dòng)態(tài)積累

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0404-02

收稿日期：2014-11-01

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（編號(hào)：12543082）；黑龍江省綏化市科技計(jì)劃（編號(hào)：KJZD20120081）。

作者簡(jiǎn)介：王斌（1980—），女，吉林敦化人，碩士，講師，主要從事天然藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)研究、藥用蕈菌活性成分研究及藥學(xué)相關(guān)的教學(xué)與科研。E-mail：wangbinkuaike@163.com。柴胡是中國(guó)應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥，2010版《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的柴胡品種為柴胡（Bupleurum chinense DC）和狹葉柴胡（B.scorzonerifolium Willd）的干燥根，前者別稱(chēng)北柴胡，后者別稱(chēng)南柴胡。柴胡性味苦甘，入肝膽經(jīng)，具有和解退熱、升舉陽(yáng)氣、疏肝解郁的功能。近代藥理研究表明，柴胡具有解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、抗炎、抗菌、抗病毒、保肝利膽、降血脂及抗消化道潰瘍等藥理活性[1]。柴胡中主要有效成分有皂苷、甾醇、揮發(fā)油、多糖等。目前，還發(fā)現(xiàn)柴胡中黃酮類(lèi)成分具有利膽、抑菌、殺菌等作用。本試驗(yàn)研究了不同采收期柴胡中皂苷、黃酮類(lèi)成分含量動(dòng)態(tài)積累，為尋求柴胡生產(chǎn)的最佳采收期及建立柴胡多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供理論依據(jù)。

1材料于方法

1.1材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于黑龍江省明水縣春草園中藥材種植公司柴胡種植基地，2013年7月2日開(kāi)始采樣，至10月6日結(jié)束，共分7期采樣，分別為：（1）7月2日；（2）7月17日；（3）8月3日；（4）8月15日；（5）9月1日；（6）9月17日；（7）10月6日。樣品為狹葉柴胡的根，采挖后立即洗去泥沙，通風(fēng)干燥，按采收時(shí)間對(duì)樣品編號(hào)。

1.2儀器

美國(guó)waters 2695 高效液相色譜儀系統(tǒng)；AB125-S 1/100 000的天平，瑞士梅特勒利多儀器（上海）有限公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；SB25-12DTD超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；分析天平FA2014，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；101-2A型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3試劑

柴胡皂苷a對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：10777-201108）、柴胡皂苷d對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：10778-201208）蕓香苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品鑒定研究院，批號(hào)：100080-200707）、乙腈、水為色譜純，乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒸餾水，氨水、甲醇以上試劑均為分析純。

1.4分析與測(cè)定

1.4.1不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的測(cè)定[2]

1.4.1.1對(duì)照品溶液的制備精確稱(chēng)取柴胡皂苷a對(duì)照品10 mg、柴胡皂苷d對(duì)照品12 mg，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻，即得。

1.4.1.2供試品溶液的制備取樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約0.5 g，精確稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入含5%濃氨試液的甲醇溶液25 mL，密塞，30 ℃超聲處理（功率200 W，頻率40 kHZ）30 min，濾過(guò)，用甲醇20 mL分2次洗滌容器及藥渣，洗液與濾液合并，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜過(guò)濾（0.45 μm），棄初濾液，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.4.1.3色譜條件以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，理論半數(shù)按柴胡皂苷a峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

表1流動(dòng)相梯度洗脫

時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）0～5025→9075→1050～559010

1.4.1.4測(cè)定法分別精確吸取對(duì)照品溶液20 μL與供試品溶液20 μL，注入色譜儀，測(cè)定即得。

1.4.2不同采收期柴胡中黃酮類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定

1.4.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。干燥恒質(zhì)量的蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加60%乙醇20 mL于水浴60 ℃溶解，配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。（2）線性關(guān)系考察。精確吸取0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液至25mL容量瓶中，加入0.7 mL 5%NaNO2，5 min后再加入0.7mL 10%Al（NO3）3，放置10 min，加入5.0 mL 4%NaOH，混勻后用30%乙醇定容至刻度，于38 ℃水浴中顯色15 min，以試劑空白對(duì)照，在510 nm處測(cè)定吸光度。以蕓香苷質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（D）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2.2樣品的測(cè)定（1）樣品溶液的制備。將樣品于 60 ℃真空干燥5 h，于粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)40目篩，貯存于具塞錐形瓶中，置干燥器中備用。稱(chēng)取粉碎的樣品粉末2.0 g，置于100 mL 錐形瓶中加入70%乙醇30 mL，用封口膜密封，浸泡12 h，超聲提取，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間15 min，超聲功率60%，提取完畢，真空過(guò)濾，取上清液。第2次提取加入70%乙醇15 mL，其他提取條件不變，合并2次的提取上清液，用70%乙醇定容至35 mL，備用。（2）樣品的測(cè)定與結(jié)果。精確吸取樣品溶液5 mL，在“1.4.1.4”節(jié)條件下測(cè)定樣品，每個(gè)測(cè)試樣品溶液平行3次測(cè)定，取平均值代入公式計(jì)算黃酮類(lèi)物質(zhì)含量。

黃酮類(lèi)物質(zhì)含量=X×7÷1 000÷m×100%。

式中：X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算換算為蕓香苷的質(zhì)量，mg；m為制備樣品測(cè)定液時(shí)稱(chēng)取的柴胡干燥粉末的質(zhì)量，g。

1.5方法學(xué)考察

1.5.1精密度試驗(yàn)精確稱(chēng)取樣品，分別按“1.4.1.2”和“1.4.1.4”節(jié)下的條件制備供試品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)操作連續(xù)記錄色譜圖5次，計(jì)算主要峰的峰面積。精密稱(chēng)取樣品，分別按“1.4.2.1”和“1.4.2.2”節(jié)下的條件制備供試品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)操作連續(xù)測(cè)吸光度各5次，計(jì)算黃酮類(lèi)物質(zhì)含量。

1.5.2加樣回收率試驗(yàn)以重復(fù)試驗(yàn)所得的柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃酮平均含量為樣品含量，精確稱(chēng)取樣品5份，加入等量對(duì)照品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)操作。

1.5.3重復(fù)性試驗(yàn)精確稱(chēng)取樣品，分別按“1.4.1.2”、“1.4.1.4”、“1.4.2.1”、“1.4.2.2”節(jié)下的條件制備供試品溶液各5份，記錄色譜圖，計(jì)算主要峰的峰面積、測(cè)定吸光度。

1.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精確稱(chēng)取樣品，分別按“1.4.1.2”、“1.4.1.4”、“1.4.2.1”、“1.4.2.2”節(jié)下的條件制備供試品溶液，分別于0、1、2、4、 8 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算主要峰的峰面積、測(cè)定吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1精密度及加樣回收率

精密度及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，精密度良好，RSD分別為1.03%、1.89%，加樣回收率為99.91 %、100.35%。表明HPLC法測(cè)定柴胡中的皂苷、亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定柴胡中的黃酮類(lèi)物質(zhì)含量方法簡(jiǎn)便、可靠、易行。

2.2重復(fù)性及穩(wěn)定性

重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，重復(fù)性良好，RSD分別為0.95%、1.14%。穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果表明，在8 h內(nèi)色譜圖、吸光度均基本穩(wěn)定。表明該測(cè)定方法重復(fù)性好且測(cè)定的數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

2.3不同采收期柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量

通過(guò)計(jì)算，不同采收期柴胡中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量不同，隨著采收期的延后，根中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、柴胡皂苷a+d含量的變化趨勢(shì)都是先下降后上升再下降。其中8月3日采收樣品皂苷含量最低，柴胡皂苷a、d含量分別為0.047%、0.050%，9月1日采收的樣品皂苷含量最高，柴胡皂苷a、d含量分別為0.203%、0.207%。

2.4不同采收期柴胡中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量

不同采收期柴胡中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量不同，隨著采收期的延后，根中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的變化趨勢(shì)是先下降后上升再下降。其中，8月15日采收的樣品黃酮類(lèi)物質(zhì)含量比較低，為0.291%，9月1日、9月17日采收的樣品黃酮類(lèi)物質(zhì)含量比較高，分別為0.416%、0.440%（圖3）。經(jīng)回歸分析得出柴胡黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的回歸方程為：y=0.379 8x+0.041 5，r=0.994 8，表明蕓香苷在0.8～2.0 mg 呈良好的線性關(guān)系。

3結(jié)論與討論

應(yīng)用HPLC法、亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測(cè)定不同采收期柴胡根中柴胡皂苷、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量，并對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行了全面的

方法學(xué)考察，其中回收率試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法排除了干擾因素，精密度良好，說(shuō)明該方法簡(jiǎn)便、可靠、易行。

采收期是藥材生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，直接影響藥材的品質(zhì)。藥材有效成分的積累具有一定的規(guī)律，按照有效成分積累規(guī)律進(jìn)行采收可以保障藥材的質(zhì)量，反之則會(huì)導(dǎo)致藥材質(zhì)量下降。在本研究中，隨著采收期的延后，根中柴胡皂苷、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量都是先下降后上升再下降。9月1日采收的柴胡皂苷、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量比較高。原因是隨著柴胡地上部分的發(fā)育，根中柴胡皂苷、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量呈下降趨勢(shì)，至9月地上部分基本停止生長(zhǎng)，其體內(nèi)的代謝物質(zhì)向根內(nèi)轉(zhuǎn)移，大部分皂苷、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量又開(kāi)始升高。王斌等對(duì)不同采收期柴胡糖類(lèi)物質(zhì)含量動(dòng)態(tài)積累規(guī)律進(jìn)行研究，結(jié)果表明，隨著采收期的延后，柴胡中總糖、多糖含量呈現(xiàn)先下降后上升再下降再上升的變化趨勢(shì)[3]。7月15日、10月2日采收的總多糖含量有2個(gè)高峰期。因此，柴胡最佳采收期還應(yīng)結(jié)合糖類(lèi)物質(zhì)及其他主要有效成分含量動(dòng)態(tài)積累的規(guī)律及藥材有效成分總產(chǎn)量來(lái)確定。

本研究首次同時(shí)以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、黃酮類(lèi)物質(zhì)含量來(lái)探討柴胡中有效成分積累規(guī)律，為柴胡多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]王斌，張騰霄，馬松艷，等. 柴胡的臨床應(yīng)用及配伍規(guī)律研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（1）：225-227.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：263.

[3]王斌，張騰霄，劉利軍. 不同采收期對(duì)柴胡糖類(lèi)物質(zhì)動(dòng)態(tài)積累的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（6）：76-78.徐燕，邱詩(shī)春. 大豆中硒的示波極譜法測(cè)定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11：406-407.