酶解程度對(duì)水飛薊蛋白理化特性的影響

朱淑云　段笑園　徐琴等

摘要：研究了不同酶解程度對(duì)水飛薊蛋白理化特性（包括氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量、溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性）的影響。結(jié)果表明：水飛薊蛋白進(jìn)行不同酶解處理后，氨基酸組成發(fā)生了變化，一些抗氧化氨基酸的含量提高，相對(duì)分子質(zhì)量變小，酶解物的溶解性提高，持油性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中水解度5%的持油性最好，酶解物的乳化性和乳化穩(wěn)定性都較酶解前有所提高。本研究結(jié)果為水飛薊蛋白的改性提供了一定的數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：水飛薊蛋白；酶解程度；理化特性；氨基酸組成

中圖分類(lèi)號(hào)： TS201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0346-02

收稿日期：2014-12-11

基金項(xiàng)目：江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐項(xiàng)目（編號(hào)：NY2012031）；江蘇大學(xué)大學(xué)生科研立項(xiàng)資助項(xiàng)目（編號(hào)：13A109）；江蘇大學(xué)大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（編號(hào)：201410299169W）。

作者簡(jiǎn)介：朱淑云（1975—），女，山東青島人， 博士，副教授，主要從事食品生物技術(shù)研究工作。E-mail：shyzhu@eyou.com。水飛薊是一種傳統(tǒng)的藥用植物，其藥用成分水飛薊素主要存在于水飛薊籽殼中，其籽仁中主要含有蛋白質(zhì)、油脂和淀粉等物質(zhì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊籽仁脫脂粉中蛋白質(zhì)含量高達(dá)47.23%，水飛薊蛋白以清蛋白為主，其氨基酸種類(lèi)齊全，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白[2-3] 。然而目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)水飛薊的研究主要集中在對(duì)水飛薊素的開(kāi)發(fā)利用上，對(duì)水飛薊蛋白的研究較少[4-6]。若對(duì)水飛薊蛋白進(jìn)行深入開(kāi)發(fā)研究，必將顯著提高水飛薊加工的附加值。蛋白質(zhì)可通過(guò)物理、化學(xué)和蛋白酶法對(duì)其進(jìn)行改性。利用蛋白酶限制性的水解蛋白來(lái)提高蛋白質(zhì)的功能特性，具有作用條件溫和，不破壞氨基酸結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生有害物質(zhì)的可能性小，安全性高等優(yōu)點(diǎn)，而且通過(guò)酶解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)更易被人體消化吸收，因此利用酶法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性已經(jīng)成為當(dāng)今最重要的蛋白質(zhì)改性技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)研究蛋白酶解改性主要集中在蛋白酶的選擇與酶解工藝的優(yōu)化，有少數(shù)研究是針對(duì)酶解程度對(duì)產(chǎn)物理化特性的影響[7-9]，但是酶解程度對(duì)水飛薊蛋白理化特性的影響尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)中性蛋白酶酶解水飛薊蛋白，考察不同酶解程度下水飛薊蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)的變化，以期為水飛薊蛋白的改性以及水飛薊活性肽的開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1材料與方法

1.1材料和試劑

水飛薊蛋白：自制；中性蛋白酶：無(wú)錫杰能科酶制劑公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

ALPHAI-4/2-4 型冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；Agilent 1100液相色譜：美國(guó)安捷倫公司；WFJ7200 可見(jiàn)光分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1水飛薊蛋白的限制性酶解方法將水飛薊蛋白配制成一定濃度的溶液，調(diào)節(jié)pH值和溫度，加入適量的中性蛋白酶進(jìn)行酶解。反應(yīng)過(guò)程中不斷加入0.5 mol/L NaOH溶液保持反應(yīng)體系的pH值恒定。當(dāng)達(dá)到預(yù)期水解度時(shí)，將反應(yīng)液置于90 ℃保溫滅酶，4 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)濃縮后冷凍干燥即得蛋白酶解物。

1.3.2水飛薊蛋白水解度的測(cè)定采用pH-stat法測(cè)水解度（DH）[10]。

1.3.3氨基酸組成的測(cè)定采用酸水解法。

1.3.4分子質(zhì)量分布的測(cè)定采用高效液相色譜法。

1.3.5溶解性的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法。準(zhǔn)確稱取0.20 g樣品溶于20 mL蒸餾水中，分別調(diào)節(jié)pH值至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室溫?cái)嚢?0 min，然后4 000 r/min離心20 min，取1.0 mL上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量。溶解度以上清液中蛋白質(zhì)含量占體系中蛋白總量的百分比表示。

1.3.6持油性和乳化性的測(cè)定按參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1酶解程度對(duì)水飛薊蛋白氨基酸組成的影響

由表1可知，不同酶解程度的水飛薊蛋白酶解物都富含谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和絲氨酸等氨基酸，隨著酶解程度的提高，各氨基酸的含量都有所變化，其中一些抗氧化氨基酸（組氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸）的含量都較酶解前有所提高，其中甲硫氨酸的含量增加最顯著，它們應(yīng)該是酶解物具有抗氧化活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，在一定程度上影響著不同酶解程度的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。

2.2酶解程度對(duì)水飛薊蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的影響

由表2可知，隨著酶解程度的增大，相對(duì)分子質(zhì)量大于1 000 u的肽段的含量逐漸減少，小于1 000 u的肽段含量則逐漸增加。在180～1 000 u范圍的組分含量由DH5%時(shí)的47.13%提高到了DH15%時(shí)的57.02%。大量研究證明：抗氧化肽多是分子質(zhì)量<1 000 u的寡肽[12]，因此，通過(guò)比較不同酶解度酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布，有助于解釋其所具有的抗氧化活性的差異。

2.3酶解程度對(duì)水飛薊蛋白溶解性的影響

水飛薊蛋白及其水解物的溶解度見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，水飛薊蛋白具有典型的溶解度曲線，其在pH值5左右具有最低的溶解度。水解物呈現(xiàn)出與蛋白完全不一樣的溶解度曲線，3種水解物在pH值5左右的低溶解性區(qū)域已消失，在所有測(cè)定的pH值范圍內(nèi)，水解物都具有較高的溶解性，不同水解度的水解物之間的溶解性也呈現(xiàn)出一定差異，隨著水解度增大，各個(gè)pH值下的溶解性略有增高。

2.4酶解程度對(duì)水飛薊蛋白持油性的影響

由圖2可知，隨著水解度的增大，酶解物的持油性逐漸降低。其中DH5%的水解物的持油性最好，比水飛薊蛋白的持油性提高了33%左右，這可能是由于低度水解時(shí)，蛋白分子結(jié)構(gòu)改變，分子中疏水基團(tuán)暴露，使水解物的吸油性顯著提高。但隨著水解度的增大，多肽鏈被降解成更短的肽段，電荷的數(shù)量增加，極性增強(qiáng)，親水基團(tuán)增加，不利于形成蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致吸油性降低[10]。

2.5酶解程度對(duì)水飛薊蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的的影響

由圖3可知，在有限水解范圍內(nèi)，中性蛋白酶水解產(chǎn)物比水飛薊蛋白具有更好的乳化性，由于水解使蛋白質(zhì)分子變小，構(gòu)象發(fā)生了改變，一些包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性殘基暴露出來(lái)，利于其向水油界面擴(kuò)散降低界面張力，同時(shí)水解后的肽分子更易定位于水油界面，所以酶解物的乳化活性較蛋白有一定的提高。由圖4可知，水解物的乳化穩(wěn)定性都高于水飛薊蛋白，但隨著水解度的增大酶解物的乳化穩(wěn)定性逐漸降低，其中DH5%的水解物的乳化穩(wěn)定性最高?？赡苁怯捎谒舛鹊倪M(jìn)一步提高，使更多極性基團(tuán)暴露，包裹在油滴表面的肽段越來(lái)越小，使油滴表面的保護(hù)層越來(lái)越薄，最終導(dǎo)致了乳化穩(wěn)定性的降低。

3結(jié)論

本研究比較了水解程度對(duì)水飛薊蛋白氨基酸組成和理化性質(zhì)的影響。研究發(fā)現(xiàn)水飛薊蛋白經(jīng)水解以后，各種氨基酸的含量都有所變化，特別是一些抗氧化氨基酸的含量都較酶解前有所提高；水解使水飛薊蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量發(fā)生了變化，隨著水解度的提高，相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽段逐漸增加；水解產(chǎn)物的溶解性顯著提高；水解產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性都較水飛薊蛋白有所提高，深度水解后的乳化穩(wěn)定性有所下降。

參考文獻(xiàn)：

[1]袁丹，張國(guó)峰，王瑞杰. 水飛薊果實(shí)、果皮及其提取物質(zhì)量評(píng)價(jià)法的研究[J]. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20（2）：119-122，131.

[2]陳毓荃，王春梅. 水飛薊綜合利用基礎(chǔ)研究Ⅱ.果實(shí)油脂和蛋白質(zhì)[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，7（1）：84-86.

[3]朱淑云，董英，陳曉東，等. 水飛薊粕蛋白氨基酸組成及加工功能特性研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2011，26（8）：71-74，83.

[4]Charrier C，Azerad R，Marhol P，et al. Preparation of silybin phase Ⅱ metabolites：Streptomyces catalyzed glucuronidation[J]. Journal of Molecular Catalysis B - Enzymatic，2014，102：167-173.

[5]Balszuweit F，John H，Schmidt A，et al. Silibinin as a potential therapeutic for sulfur mustard injuries[J]. Chemico-Biological Interactions，2013，206（3）：496-504.

[6]Sadava D，Kane Susan E. Silibinin reverses drug resistance in human small-cell lung carcinoma cells[J]. Cancer Letters，2013，339（1）：102-106.

[7]Zhao G L，Liu Y，Zhao M M，et al. Enzymatic hydrolysis and their effects on conformational and functional properties of peanut protein isolate[J]. Food Chemistry，2011，127（4）：1438-1443.

[8]劉遠(yuǎn)洋，顧煒，郭健，等. 酶解程度對(duì)花生蛋白理化性質(zhì)及功能特性的影響[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2012，27（2）：27-31.

[9]Wang J S，Su Y J，Jia F，et al. Characterization of casein hydrolysates derived from enzymatic hydrolysis[J]. Chemistry Central Journal，2013，7（1）：62.

[10]王素雅，劉勝，鞠興榮，等. 中性蛋白酶限制性水解對(duì)高溫菜籽粕蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（1）：56-59.

[11]朱淑云，董英，肖香，等. 水飛薊蛋白組分的理化特性研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28（10）：15-20.

[12]Zambrowicz A，Timmer M，Polanowski A，et al. Manufacturing of peptides exhibiting biological activity[J]. Amino Acids，2013，44（2）：315-320.謝宇奇，零學(xué)仕，周作樹(shù)，等. 楓香樹(shù)葉黑色素粗產(chǎn)品提取工藝的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11：348-351.