南疆雞群感染H9N2亞型AIV診斷分析

劉永宏　亞克甫·玉蘇普++玉蘇普·卡斯木等

摘要：為了證實(shí)南疆雞群感染了H9N2亞型AIV，對(duì)2個(gè)雞場(chǎng)6份疑似H9N2亞型AIV感染病雞組織病料，進(jìn)行H9N2亞型AIV HA和NA基因部分片段擴(kuò)增、測(cè)序及序列分析。結(jié)果表明，南疆該雞場(chǎng)感染了H9N2亞型AIV。因此，南疆地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)重視該病的預(yù)防和控制。

關(guān)鍵詞：南疆；禽流感；H9N2亞型

中圖分類號(hào)： S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0303-03

收稿日期：2014-11-03

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31460655）；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)塔里木大學(xué)科研聯(lián)合基金（編號(hào)：HNTDLH1404）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號(hào)：HS2014011）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士資金（編號(hào)：2012BB023）；塔里木大學(xué)高教研究項(xiàng)目（編號(hào)：TDGJ1409）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：20140757023）。

作者簡介：劉永宏，男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，博士，研究方向?yàn)閭魅静∨c免疫病理學(xué)。E-mail： lyhdky@126.com。

通信作者：趙麗。流感病毒（influenza virus，IV）是正黏病毒科流感病毒屬成員，根據(jù)病毒粒子中NP和M蛋白的抗原差異，分為甲（A）、乙（B）和丙（C）3型，其中A型流感病毒的抗原變異性最強(qiáng)，常引起世界性大流行。A型流感病毒基因組為8個(gè)分節(jié)段負(fù)鏈RNA，編碼12～13種病毒蛋白。A型流感病毒根據(jù)2種表面蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性特點(diǎn)分為不同的亞型，已證明有16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型[1-5]。HA和NA基因可作為RT-PCR方法的靶序列基因，用于AIV的亞型鑒別。

1966年Homme等分離到第1株H9N2亞型AIV[6]，此后H9N2亞型AIV在世界各地廣泛流行。1988年，香港在亞洲范圍內(nèi)第1次從陸禽中分離到3株H9N2亞型AIV[7]。1994年陳伯倫等分離到中國第1株H9N2亞型AIV[8]，后來發(fā)現(xiàn)H9N2亞型AIV在我國各地普遍存在，2009年新疆報(bào)道從野生灰雁中分離到H9N2亞型AIV[9]，新疆也報(bào)道了個(gè)體養(yǎng)殖戶麻花雞感染H9亞型AIV[10]。H9N2亞型AI多呈低致病性感染，但由于分布廣泛且呈蔓延之勢(shì)，有重組為強(qiáng)毒的可能性，因此給養(yǎng)禽業(yè)造成的威脅不容忽視。本研究對(duì)南疆發(fā)病疑似H9N2亞型AIV感染雞組織病料，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增HA和NA基因部分片段，并測(cè)序確定其亞型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料6份病雞組織病料，來自2013年南疆地區(qū)2個(gè)雞場(chǎng)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑Trizol invitrogenTM（編碼.：15596-026），購自Invitrogen生物工程有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（編碼.：DRR019A），Premix Taq Version2.0（編碼.：D331A）和DNA Marker 2000，購自寶生物工程（大連）有限公司；TIANgel Midi Purification Kit（編碼.：DP209），購自天根生化科技（北京）有限公司等。

1.1.3引物按照引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer Premier 5.0分子生物學(xué)軟件，以GenBank數(shù)據(jù)庫中國內(nèi)外已發(fā)表的H9N2亞型AIV的HA和NA基因全序列為參照設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列為HA：5′-TGCAACAAATCTGGGACA-3′，5′-AGGCGACAGTCGAATAAA-3′；NA：5′-TTGCGACAA-TATGTTTCC-3′，5′-GCTATTTGAAGTCCACCAC-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，預(yù)期大小約為 1 420、1 270 bp。

1.1.4儀器PCR儀：TC-5000，比比科技有限公司；小型高速冷凍離心機(jī)：R134a，密封式制冷系統(tǒng)；電泳儀：DYY-12，北京市六一儀器廠；紫外分析儀：JY02S，北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司等。

1.2方法

1.2.1總RNA提取從病雞組織病料中提取總RNA，按Trizol invitrogenTM試劑盒說明書操作。

1.2.2RT-PCR反應(yīng)總RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒，利用已設(shè)計(jì)的特異性引物，進(jìn)行一步法擴(kuò)增HA或NA基因片段，退火溫度均為51 ℃。cDNA同時(shí)加HA和NA特異性引物，作為陰性對(duì)照。

1.2.3PCR產(chǎn)物純化回收取HA或NA基因片段RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳切膠后，按照TIANgel Midi Purification Kit試劑盒說明進(jìn)行回收純化。

1.2.4測(cè)序?qū)⒓兓a(chǎn)物標(biāo)記后送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為HA或NA基因擴(kuò)增引物。

1.2.5序列分析利用BLAST在線平臺(tái)分析與本研究獲得的HA或NA基因片段同源性較高的序列，判斷本研究毒株的亞型。

2結(jié)果與分析

2.1AIV HA和NA基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

本研究的6例樣品，根據(jù)HA和NA特異性引物RT-PCR擴(kuò)增相應(yīng)基因片段，結(jié)果均為陽性，2個(gè)片段產(chǎn)物均與預(yù)期擴(kuò)增長度一致，陰性對(duì)照成立（圖1）。

2.2BLAST在線比對(duì)結(jié)果

本研究將6例樣品經(jīng)RT-PCR、膠回收純化和測(cè)序得到HA和NA部分基因序列，利用BLAST在線平臺(tái)分析，在線結(jié)果顯示，與其同源性由高到低的100個(gè)序列均為H9或N2。

3結(jié)論與討論

禽流感分為高致病性禽流感和低致病性禽流感。高致病性禽流感主要由H5或H7亞型AIV引起，發(fā)病率和病死率均高，全球?qū)ζ涓叨戎匾?。另外，全球人感染H5N1亞型AIV病例至少649例，死亡385例，病死率達(dá)到59.32%[11]。2013年，中國十幾個(gè)城市百余人感染H7N9亞型AIV，死亡40余人，研究表明，H7N9流感病毒能夠發(fā)生有限的人傳人[12]。因此，全球?qū)Ω咧虏⌒郧萘鞲懈又匾暋５椭虏⌒郧萘鞲型滤缆瘦^低，表現(xiàn)為輕度呼吸道癥狀和產(chǎn)蛋率下降等，而未被重視。對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害最嚴(yán)重的低致病性禽流感亞型主要為H9N2，1996—2000年，中國H9N2亞型AI的發(fā)病率占AI總發(fā)病率的93.89%[13]。1999年以來，H9N2亞型AIV感染人事件的多次發(fā)生，嚴(yán)重威脅了世界公共衛(wèi)生[14]。另外，AIV變異性較強(qiáng)較快，當(dāng)2種低致病性毒株同時(shí)感染雞，可能會(huì)發(fā)生毒株變異和重組，產(chǎn)生強(qiáng)毒株，導(dǎo)致雞群遭受嚴(yán)重?fù)p傷。因此，H9N2亞型AI應(yīng)該被高度重視。

目前，中國對(duì)禽流感的防制措施主要是疫苗接種，但現(xiàn)在不同公司選用的H9N2亞型疫苗株不同，導(dǎo)致疫苗株繁多，某些地區(qū)不清楚當(dāng)?shù)亓餍兄晔鞘裁?，不清楚選用哪個(gè)毒株預(yù)防效果最好，且免疫程序混亂。此外，養(yǎng)殖戶對(duì)禽流感，尤其低致病性禽流感認(rèn)識(shí)不夠，防疫意識(shí)不夠，對(duì)免疫監(jiān)測(cè)更是一無所知。所以，導(dǎo)致H9N2亞型AI在國內(nèi)控制效果一直不能令人滿意。2009—2010年，在新疆部分地區(qū)蛋雞、肉雞、家養(yǎng)水禽的養(yǎng)殖場(chǎng)，H9免疫抗體合格率為62.4%～100.0%，20%～33%蛋雞場(chǎng)存在100%的零效價(jià)現(xiàn)象，活禽市場(chǎng)H9抗體合格率為21.70%～67.14%[15]。2013年，發(fā)現(xiàn)新疆和田縣未免疫H9疫苗養(yǎng)殖戶HI抗體感染率為35.29%，意味著和田縣存在H9亞型禽流感發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[16]。

2009—2011年，新疆野鳥檢出了禽流感H1～H16全部亞型，不同野鳥各亞型檢出率不同，其中野鴨類H9檢出率最高[17]。野鳥帶毒卻很少發(fā)病或死亡，往往成為重要的病原攜帶者，隨著候鳥的遷徙，與留鳥及家禽的接觸，而將疫情進(jìn)一步擴(kuò)散。因此，AI的暴發(fā)流行除了與禽及禽產(chǎn)品貿(mào)易流通因素有關(guān)之外，野生鳥類被認(rèn)為是最有可能的傳染來源之一。研究結(jié)果表明，濕地和水棲野鳥，如雁形目和鸻形目是AIV主要的天然儲(chǔ)存者[17]。新疆濕地資源豐富，每年數(shù)以萬計(jì)的遷徙性鳥類途徑新疆，并在南北疆地區(qū)棲息和繁殖。因此，野生鳥類的遷徙對(duì)新疆地區(qū)乃至我國AI的防控造成潛在的威脅和巨大的壓力。1994年，新疆石河子報(bào)道了國內(nèi)外首次從雞中分離出的H14亞型禽流感分離株[18]，證實(shí)了新疆AIV毒株的豐富。

近年來，不同動(dòng)物流感病毒跨越種間屏障感染的報(bào)道越來越多，目前已經(jīng)從多種家禽，如水禽、豬、馬、狗、貓科動(dòng)物、海洋哺乳動(dòng)物以及人類中分離到AIV。豬是AIV“禽—豬—人”傳播鏈的重要中間宿主。2009—2011年，新疆報(bào)道豬、狗H9亞型抗體陽性[19]，加之豬、狗與人類的密切關(guān)系，這無疑對(duì)新疆地區(qū)流感的防控構(gòu)成一定的潛在威脅，對(duì)流感的發(fā)生與流行發(fā)出了重要的預(yù)警。

禽流感對(duì)新疆乃至中國潛在威脅巨大，提醒相關(guān)人群應(yīng)足夠重視該病的防控[20-21]。本研究根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀檢查和病雞剖檢，疑似南疆2個(gè)雞場(chǎng)雞群感染低致病性禽流感。影響我國養(yǎng)禽業(yè)的低致病性AIV主要為H9N2亞型，針對(duì)已發(fā)表的H9N2亞型AIV毒株序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增HA和NA基因部分片段的特異性引物，并將擴(kuò)增產(chǎn)物純化測(cè)序分析。本研究所得的HA基因片段序列，經(jīng)BLAST在線分析，與其同源性由高到低的100個(gè)序列，均為H9亞型；本研究所得的NA基因片段序列，經(jīng)BLAST在線分析，與其同源性由高到低的100個(gè)序列，均為N2亞型。研究結(jié)果表明，2個(gè)雞場(chǎng)雞均感染H9N2亞型AIV。雖然2個(gè)雞場(chǎng)常年發(fā)生類似癥狀疾病，但附近相似飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)技術(shù)、飼養(yǎng)環(huán)境和免疫標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)的和田黑雞，通過多次試驗(yàn)并未檢出感染H9N2亞型AIV。和田黑雞是否具有H9N2亞型AIV抗性，需要進(jìn)一步觀察研究，如果研究證實(shí)，和田黑雞可能會(huì)成為抗AIV研究的良好材料。

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