表達(dá)hpa1Xoo基因棉花對黃萎病抗性及農(nóng)藝性狀的影響

劉悅　金中時(shí)　王鳳良等

摘要：黃萎病是棉花生產(chǎn)中最具毀滅性病害之一，種植抗病品種是控制黃萎病害最為有效途徑之一。本試驗(yàn)通過花粉管通道法將hpa1Xoo基因?qū)腙懙孛奁废?54，經(jīng)多代選育獲得了可穩(wěn)定遺傳表達(dá)hpa1Xoo基因且農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的2個(gè)棉花材料854-3、854-5，具有出苗快、長勢較好、整齊度高、植株中等、株型松、莖稈毛少光滑、葉片大、葉色深綠、葉功能較好、結(jié)鈴性較強(qiáng)、鈴形較大、吐絮暢等特點(diǎn)。2013—2014年854-3、854-5株高98.0～114.0 cm，單株果枝15.60～18.10個(gè)，單株結(jié)鈴26.90～48.45個(gè)，鈴質(zhì)量5.26～5.92 g，衣分39.54%～45.10%，籽棉產(chǎn)量3 186.45～5 023.65 kg/hm2，皮棉產(chǎn)量1 437.5～1 998.45 kg/hm2。854-3、854-5黃萎病指數(shù)分別為4.23、2.80，均為高抗水平。854-3、854-5纖維上半部平均長度分別為28.78、28.83 mm，斷裂比強(qiáng)度分別為27.9、28.4 cN/tex，馬克隆值分別為5.67、5.83，伸長率分別為6.3%、6.2%。854-3、854-5纖維外觀色澤潔白，手感有彈性，內(nèi)在品質(zhì)優(yōu)良，可為棉花抗病品種選育提供種質(zhì)或材料。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因棉花；hpa1Xoo基因；抗黃萎?。晦r(nóng)藝性狀

中圖分類號： S435.621文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0170-05

收稿日期：2015-02-06

基金項(xiàng)目：教育部博士點(diǎn)基金（編號：20104601110004、20124601110004）；國家自然科學(xué)基金（編號：31160359、31360029）；國家科技部項(xiàng)目（編號：2004BA901A36）。

作者簡介：劉悅（1990），女，黑龍江人，碩士研究生，從事植物病理學(xué)研究。E-mail：heizi2327@126.com。

通信作者：繆衛(wèi)國，博士，教授，從事分子植物病理學(xué)研究。E-mail：weiguomiao1105@126.com。在世界范圍內(nèi)棉花是非常重要的纖維作物，也是食用油料來源之一。是僅次于糧食的第二大農(nóng)作物[1]。黃萎病是棉花成株期危害最大的病害之一。棉花黃萎病的病原菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahlia Klebahn），對棉花質(zhì)量、皮棉產(chǎn)量、纖維品質(zhì)影響非常嚴(yán)重[2-3]。1993年，棉花黃萎病在我國大暴發(fā)，發(fā)病面積達(dá)266.67萬 hm2，損失皮棉約1億 kg，2002—2003年黃萎病再度暴發(fā)，棉花黃萎病已成為棉花減產(chǎn)的主要原因之一[4-5]。選育高產(chǎn)抗病品種對有效控制該類病害尤為重要。多年來，我國對篩選與培育新品種的方法不斷更替革新，由開始常規(guī)棉育種至現(xiàn)在利用轉(zhuǎn)基因、分子標(biāo)記與生化輔助育種等技術(shù)，定向、高效培育出高產(chǎn)、抗病蟲、優(yōu)質(zhì)的復(fù)合抗性品種[6]。如轉(zhuǎn)基因Bt抗蟲棉，不僅在抗棉鈴蟲方面有顯著成效，還能夠增強(qiáng)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)害蟲自然控制的能力，世界范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了大范圍的推廣種植[7-8]。但至今對于抗病轉(zhuǎn)基因棉的研究成效甚微，未見抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花大面積種植的報(bào)道，生產(chǎn)上大面積種植的棉花品種對棉花黃萎病的抗性仍處于抗病或耐病水平，缺乏高抗黃萎病棉花品種的報(bào)道。

Wei等首次從梨火疫病菌（Erwinia amylovora）中分離和鑒定了一種能夠激發(fā)非寄主植物發(fā)生過敏性反應(yīng)（hypersensitive resistence，HR）的蛋白激發(fā)子，命名為harpinEa[9]。目前，人們已經(jīng)在Erwinia、Psedomonas、Xanthomonas等屬的多種植物病原細(xì)菌中克隆到編碼harpin蛋白的hrp（hypersensitive response and pathogenicity，hrp）基因[10-17]。人們已經(jīng)將編碼harpin蛋白的基因成功轉(zhuǎn)入到煙草、馬鈴薯、蘋果、梨、甜菜、小麥、棉花[18-26]及水稻[15，17，27-29]等植物中，獲得的轉(zhuǎn)基因植物都對其主要病原菌產(chǎn)生了較好的復(fù)合抗性。

hpa1Xoo是來自水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）編碼harpinXoo蛋白的hrp基因[17]，筆者項(xiàng)目組用含農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)域的重組質(zhì)粒，通過花粉管通道法將hpa1Xoo基因?qū)攵鄠€(gè)陸地棉，結(jié)合常規(guī)育種獲得具有多種有益表型如抗棉花黃萎病、枯萎病、棉鈴蟲等的后代株系[30]。在此基礎(chǔ)上，2008—2014年項(xiàng)目組選用抗病較差但農(nóng)藝性狀較好的陸地棉材料854，將hpa1Xoo基因?qū)?54，通過系統(tǒng)選育獲得了穩(wěn)定表達(dá)的后代株系854-3、854-5，在2013—2014年對854-3、854-5的黃萎病抗性、農(nóng)藝性狀等方面與泗棉3號、中植棉2號進(jìn)行了比較，以期為棉花抗病品種選育及病害有效防控提供優(yōu)良種質(zhì)。

1材料與方法

1.1材料

陸地棉材料854-3、854-5是以854（江蘇科騰種業(yè)有限公司提供）為轉(zhuǎn)化受體的轉(zhuǎn)hpa1Xoo基因棉花的遺傳穩(wěn)定后代株系，抗性標(biāo)記基因?yàn)閚ptⅡ[28]。對照為中植棉2號（抗?。裘?號（感?。?。

1.2試劑

卡那霉素（5 000 mg/L）、膠回收試劑盒、DNA試劑盒與RNA試劑盒均購自BIOMIGA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TianGen公司；GoldView DNA染料購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；引物由華大基因引物合成。DNA測序由華大基因完成。

1.3方法

1.3.1卡那霉素抗性篩選參照繆衛(wèi)國的方法[31]，當(dāng)棉苗長出2～3張真葉時(shí)，用5 000 mg/L濃度的卡那霉素對葉片均勻涂抹，無黃色斑痕的為卡那霉素抗性植株，以此作為陽性植株進(jìn)行下一步分子篩選。

1.3.2轉(zhuǎn)基因棉抗病性考察試驗(yàn)選擇在江蘇大豐大中鎮(zhèn)紅花村發(fā)病均勻的棉花黃萎病重病田進(jìn)行，田間管理同大田常規(guī)方法。病情考察分2個(gè)時(shí)期進(jìn)行，黃萎病第1發(fā)病峰在棉花蕾花期（7月中下旬），黃萎病第2發(fā)病峰在棉花鈴期（9月下旬），調(diào)查發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)，參照顧本康等的方法[32]劃分抗病等級。

1.3.3農(nóng)藝性狀調(diào)查棉花采用育苗移栽的方式種植，4月中旬播種，5月中旬移栽。試驗(yàn)田采用隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次，小區(qū)長8 m、寬4 m，行距1 m，株距30 cm，每個(gè)區(qū)組設(shè)1個(gè)感病對照（泗棉3號）、1個(gè)抗病對照（中植棉2號）。調(diào)查項(xiàng)目包括吐絮期株高、單株果枝數(shù)、單株鈴數(shù)和吐絮個(gè)數(shù)，并考察皮棉、籽棉產(chǎn)量、單鈴質(zhì)量、衣分等指標(biāo)。采集植株中部鈴50個(gè)，稱量其纖維20～30 g送檢（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所農(nóng)業(yè)部棉花纖維檢測中心檢測）。

1.3.4統(tǒng)計(jì)分析參照顧本康等的抗病性鑒定方法[32]，抗病性指標(biāo)計(jì)算公式如下：

發(fā)病率=（∑病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%；

病情指數(shù)=[∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)病級）/（調(diào)查總株數(shù)×4）]×100%；

相對抗性指數(shù)（IR）=校正系數(shù)K×鑒定材料病指；

校正系數(shù)K=50/本次鑒定感病對照病指（50為感病對照標(biāo)準(zhǔn)病指）。

比較854-3、854-5這2個(gè)株系（材料）與對照品種在2013—2014年的抗病性與農(nóng)藝性狀，對均值進(jìn)行t測驗(yàn)，依據(jù)測驗(yàn)值的顯著水平確定供試材料的品質(zhì)優(yōu)劣。

1.3.5PCR與RT-PCR檢測采用DNA提取試劑盒（E.Z.N.A. HP Plant DNA Kit）提取棉花4～5張真葉期時(shí)的葉片總DNA，參照繆衛(wèi)國等方法[31]，用引物hpa1Xoo（Forward：5′-TTCGGATCCATGAACTCTTTGAACACACAATT-3′；Reverse：5′-GGTGAGCTCTTACTGCATCGATGCGCT-3′） PCR擴(kuò)增目的基因hpa1Xoo全長。其程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min，然后95 ℃變性45 s，56 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min，此循環(huán)進(jìn)行35次；最后72 ℃延伸10 min。

利用RNA提取試劑盒（E.Z.N.A. Plant RNA Kit RNA）提取花鈴期棉葉的RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Quant Reverse Transcriptase）進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。使用hpa1Xoo引物（同上），以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR，程序同上。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因棉花的黃萎病抗性

2008年，我們采用花粉管通道法結(jié)合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將來自水稻白葉枯病菌編碼harpin蛋白的hpa1Xoo基因?qū)胧荏w陸地棉材料854[30]，通過卡那抗性和抗病性田間篩選，結(jié)合分子驗(yàn)證，經(jīng)單株選育，獲得了854-3、854-5，2個(gè)農(nóng)藝表型穩(wěn)定的材料。2013—2014年，繼續(xù)觀察854-3、854-5農(nóng)藝性狀和對黃萎病的抗病性。結(jié)果表明，在江蘇大豐大中鎮(zhèn)紅花村棉花黃萎病重病田，抗病對照中植棉2號相對病情指數(shù)為12.41～16.68，平均為14.54，感病對照泗棉3號病情指數(shù)為42.76～50.00，平均為46.38，每年3個(gè)區(qū)組的感病對照泗棉3號黃萎病病情指數(shù)均在50左右，重復(fù)間、年度間差異不顯著，表明供試黃萎病病田發(fā)病均勻，適宜做病圃開展棉花品種（材料）抗病性鑒定（表1）。854-3、854-5在2013—2014年平均病情指數(shù)分別為4.23、2.80，最高為6.01，最低為2.02，分別較抗病對照中植棉2號相對病情指數(shù)低70.9%、80.7%，較感病對照泗棉3號相對病情指數(shù)低 90.9%、94.0%，參照棉花品種抗性劃分標(biāo)準(zhǔn)[32]，二者均屬于高抗。

2.2轉(zhuǎn)基因棉花的主要農(nóng)藝性狀及經(jīng)濟(jì)性狀

2.3轉(zhuǎn)基因棉花纖維品質(zhì)性狀

2014年，對854-3、854-5纖維樣品進(jìn)行品質(zhì)檢測，纖維品質(zhì)性狀良好，纖維長度分別為28.78、28.83 mm，比強(qiáng)度分別為27.9、28.4 cN/tex，馬克隆值分別為5.67、5.83，伸長率分別為6.3%、6.2%，整齊度分別為85.4%、84.7%（表3）。

2.4PCR、RT-PCR、PCR-Southern blot檢測結(jié)果

從整齊排列生長一致的株行中，分別隨機(jī)選擇854-3、854-5材料各2株。以葉片基因組DNA為模版，用hpa1Xoo引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1-A）。將上述PCR產(chǎn)物電泳后，以地高辛標(biāo)記的hpa1Xoo全長序列為探針，進(jìn)行PCR Southern blot。以水稻白葉枯菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）PXO99菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR的產(chǎn)物為陽性對照。PCR Southern blot結(jié)果，854-3、854-5陽性對照均在400～500 bp間出現(xiàn)了明顯的陽性信號（圖1-B）。RT-PCR檢測是以隨機(jī)選擇854-3、854-5 2材料各4株的葉片基因組RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄后，同樣以hpa1Xoo引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2）。分子檢測所得到的目的條帶單一，測序結(jié)果為hpa1Xoo，表明引物特異性很高，并且經(jīng)多代選育后轉(zhuǎn)入的外源基因hpa1Xoo仍然能夠在棉花內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在世代間穩(wěn)定遺傳。

3討論

Harpin蛋白在病原菌與植物互作過程中不僅能賦予轉(zhuǎn)基因植物抗病蟲性，而且能夠激發(fā)一些防衛(wèi)基因的表達(dá)[31，33]。如能夠誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗性[34]，能在多種植物上誘導(dǎo)過敏性細(xì)胞死亡[35]，并能夠啟動(dòng)水楊酸[36]、茉莉酸/乙烯[37]、脫落酸[38]等信號傳導(dǎo)途徑。不僅編碼Harpin蛋白的基因可以作為外源基因?qū)?，還起到抗病蟲、提高品質(zhì)的作用，而且在植物上的直接施用也能夠賦予植物較好的抗病性[19，39]。多年來，人們已經(jīng)從多種植物病原細(xì)菌中克隆得到編碼harpin蛋白的hrp基因，并成功將其轉(zhuǎn)入到不同的作物中，使轉(zhuǎn)基因植物獲得了抗性，不同程度上提高了農(nóng)作物的品質(zhì)，例如將編碼harpin蛋白的基因成功轉(zhuǎn)入到煙草[18-21]、馬鈴薯[22]、蘋果[25]、梨[24]、甜菜[18]、小麥[25]、棉花[26]及水稻[15，17，27-29]等植物中，獲得的轉(zhuǎn)基因植物都對其主要的病原菌產(chǎn)生了較好的復(fù)合抗性。將編碼水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）編碼harpin蛋白的hpa1Xoo基因轉(zhuǎn)入水稻中，使得轉(zhuǎn)基因水稻獲得良好的復(fù)合抗性[15，17，27-29]?？娦l(wèi)國將hpa1Xoo基因?qū)氲矫藁╖35中，hpa1Xoo基因的表達(dá)可以促進(jìn)防衛(wèi)反應(yīng)，有效降低了棉花黃萎病的發(fā)生，培育篩選過程中還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)hpa1Xoo基因棉花不僅對黃萎病有抗性，而且對枯萎病、立枯病也有很好的抗病性，對棉鈴蟲、棉薊馬、棉大卷葉螟也有較好的抗蟲性[31]，也就是說harpin能夠賦予植物多種復(fù)合抗性。本試驗(yàn)中筆者選取了江蘇科騰種業(yè)有限公司提供的棉花材料854，該材料適于長江中下游種植，將hpa1Xoo基因轉(zhuǎn)入854中，經(jīng)過2008—2014年獲得了適于長江中下游種植的棉花材料854-3、854-5，二者兼具高抗黃萎病及良好的農(nóng)藝性狀。

近年來，研究選育的棉花品種（材料）多為耐黃萎病品種，少部分為抗黃萎病品種，如冀雜1號黃萎病指數(shù)163[40]，冀棉169黃萎病指數(shù)12.5[41]，遼棉20號、遼棉25號、中棉91、遼K133黃萎病指數(shù)分別為16.3、13.0～18.85、248、20.83[42]等，現(xiàn)今仍缺乏高抗黃萎病的品種（材料）。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育棉花抗病品種成為目前最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。不論采用常規(guī)育種還是分子育種技術(shù)培育高抗黃萎病的棉花品種，均存在一定的瓶頸，主要體現(xiàn)在一是缺乏高抗黃萎病的抗源，二是棉花對黃萎病菌的抗性遺傳特性還存在一些理論和技術(shù)性的問題。針對黃萎病的抗性品種育種，時(shí)常會(huì)發(fā)現(xiàn)某一個(gè)材料或者品系在獨(dú)特年份表現(xiàn)出較好的抗病性，但這種抗性不像對枯萎病抗性會(huì)具有較好的持久性，在后續(xù)種植過程中會(huì)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)品種對黃萎病的抗性又減弱或者丟失，這是困擾抗黃萎病品種選育的一個(gè)較突出的問題。目前，我們獲得的854-3、854-5 2個(gè)棉花材料的黃萎病指數(shù)分別為4.23、2.80，在連續(xù)種植的2年中都保持著高抗黃萎病，農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良，有望作為抗黃萎病品種培育過程中的種質(zhì)或材料。

盡管轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化發(fā)展速度快前景好，能為社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)利益，但不可忽視的是轉(zhuǎn)基因作物確實(shí)存在一系列潛在的安全問題。轉(zhuǎn)基因作物安全性包括兩方面：食品安全性問題和環(huán)境安全性問題。為能夠安全持久種植利用轉(zhuǎn)基因作物，在轉(zhuǎn)基因作物商品化前要對其可能帶來的環(huán)境生物安全問題進(jìn)行嚴(yán)格、充分的科學(xué)研究和評價(jià)，并進(jìn)行有效的生物安全監(jiān)測和管理[43-48]。我們獲得的轉(zhuǎn)hpa1Xoo基因棉花均規(guī)范種植，設(shè)立了隔離帶，按照相關(guān)規(guī)定對轉(zhuǎn)基因品種產(chǎn)業(yè)化采取嚴(yán)格謹(jǐn)慎的管理和審批，在盡量消除和降低安全隱患的基礎(chǔ)上科學(xué)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以促進(jìn)整個(gè)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

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