中華蜜蜂OBP17基因CDS序列及其表達與抗螨性狀的相關性

殷玲　吉挺　李冠華等

摘要：OBP17是蜜蜂氣味結合蛋白質（odorant binding proteins，OBPs）家族中的成員，參與氣味分子的識別，對嗅覺起重要作用。蜜蜂的抗螨性狀與嗅覺密切相關，為研究蜜蜂OBP17基因的功能及其與抗螨性狀的相關性，以中華蜜蜂頭部組織cDNA為模板，PCR擴增OBP17基因完整CDS序列，利用生物信息學方法分析CDS序列及其編碼的氨基酸序列，利用RT-PCR方法檢測OBP17基因在不同抗螨性狀的中華蜜蜂頭部組織中的相對表達量。結果表明，OBP17基因CDS全長為408 bp，編碼135個氨基酸的分泌性蛋白，無跨膜螺旋，是比較保守的基因；RT-PCR檢測結果顯示，在蜂螨脅迫下的中華蜜蜂頭部組織中，OBP17基因的表達量顯著高于未受脅迫的抗性群體及受到同等蜂螨脅迫的敏感性群體。中華蜜蜂OBP17基因的表達變化與蜂螨感染過程相關，說明OBP17基因在中華蜜蜂的抗螨行為中起重要作用。

關鍵詞：中華蜜蜂；OBP17；克?。簧镄畔W；狄斯瓦螨

中圖分類號： S895.3+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0045-04

收稿日期：2015-01-22

基金項目：國家自然科學基金（編號：31372382）；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)技術學院重點科研課題（編號：NSFRC1401）。

作者簡介：殷玲（1983—），女，江蘇泰興人，博士，講師，主要從事蜜蜂分子生物學研究。E-mail：lingyin_txx@163.com。昆蟲通過嗅覺受體神經(jīng)元的調節(jié)來識別并區(qū)分成千上萬種氣味復合物，而氣味結合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）家族則承擔特異性識別、轉運氣味復合物至受體的運輸功能[1]，因此氣味結合蛋白與昆蟲的嗅覺敏感性密切相關。目前，國內外關于蜜蜂OBPs家族的基因功能研究較少，關于中華蜜蜂OBPs家族的研究更少。李紅亮等對ASP2進行CDs的克隆，并對其功能模式進行分析[2-3]；張小輝等克隆了中華蜜蜂氣味結合蛋白5、9、11、12的完整基因序列[4]；陳揚等對中華蜜蜂頭部CSP3基因的CDS序列進行分析[5]。OBP17是蜜蜂氣味結合蛋白質家族中的成員，是低分子量水溶性酸性蛋白質，有6個保守的半胱氨酸位點，在西方蜜蜂的身體各部位均有表達[6]，但其具體功能卻不得而知。

狄斯瓦螨（Varroa destructor）別稱大蜂螨，是對世界養(yǎng)蜂業(yè)威脅最大的蜜蜂病蟲害，對西方蜜蜂產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失[7]，也是我國最重要、必須嚴加防范的蜜蜂寄生蟲害[8]。中華蜜蜂（Apis cerana cerana）是東方蜜蜂的地理品種，生活于我國境內，狄斯瓦螨對其并不造成傷害[9]。周婷對我國主要中蜂飼養(yǎng)區(qū)的大蜂螨寄生狀態(tài)進行了調查，發(fā)現(xiàn)中蜂群中螨的寄生率極低，有些地區(qū)的中蜂群中甚至難以找到狄斯瓦螨的蹤跡，但也有極少數(shù)群體出現(xiàn)與西方蜜蜂感染蜂螨相同的癥狀，如花子、殘翅等[10]。很多研究表明，嗅覺敏感性強的蜜蜂可以迅速察覺并區(qū)分正常與不正常幼蟲的氣味，其清潔行為更易被激發(fā)[11-12]。蜜蜂嗅覺敏感性的差異可導致其清潔及梳理行為的差異，從而導致抗螨性狀的差異[13]；雖然這一機理被廣泛接受，但其分子機制卻不清晰。

本研究以中華蜜蜂頭部組織cDNA為模板，PCR擴增OBP17基因完整CDS序列，利用生物信息學方法分析CDS序列及其編碼的氨基酸序列，并在蜂螨脅迫及沒有蜂螨脅迫的條件下，利用RT-PCR方法檢測OBP17基因在不同抗螨性狀的中華蜜蜂頭部組織中的相對表達量，以期為蜜蜂OBP17基因的功能及其與抗螨性狀相關性的研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗蜂群及蜂螨脅迫

本試驗選用廣東昆蟲研究所實驗蜂場內具有蜂螨抗性、蜂螨敏感性的中華蜜蜂群體各2群。將2張狄斯瓦螨感染程度相當?shù)某财⒎謩e放入蜂螨抗性中華蜜蜂、蜂螨易感性中華蜜蜂的蜂箱內，對照組放入無蜂螨感染的西方蜜蜂巢脾，脅迫24 h后進行樣本采集，4個蜂群各采集150只哺育蜂（18日齡以內）。

1.2總RNA的提取、檢測、反轉錄

采用Trizol法提取中華蜜蜂頭部組織的總RNA。以總RNA為模板，使用First Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司產(chǎn)品）并參照說明書進行反轉錄，合成cDNA第1鏈。

1.3CDs的克隆測序

1.4序列分析

利用BLAST軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析序列的同源性；利用clustalw軟件（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html）分析OBP17基因與近源物種相同基因的差異；利用ExPASy網(wǎng)站的ProtScale程序（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）分析蛋白疏水性結構；對蛋白質跨膜結構進行預測（http：//www.ch.embnet.org/sortware/TMPRED-form.html），并對信號肽區(qū)域進行分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalP/）；利用在線工具（http：//www.ch.embnet.org/software/COILs-form.html/）進行跨膜螺旋預測；利用PSIPRED v3.0軟件（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）預測目的蛋白的二級結構。

1.5實時定量PCR引物設計及目的片段擴增

根據(jù)獲得的OBP17基因CDs序列及β-actin（登錄號：AB023025）外顯子序列，利用Premier primer 5.0軟件設計引物（表1）。

2結果與分析

2.1東方蜜蜂OBP17基因克隆及序列分析

PCR擴增OBP17基因目的條帶（466 bp），經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在400～500 bp之間可見1條清晰的特異性條帶（圖1）。測序結果顯示，其長度為466 bp，包含完整的CDS序列408 bp，編碼135個氨基酸，序列已提交至Genbank（登陸號KM591216.1）。

利用clustal x軟件將中華蜜蜂與其他昆蟲類的OBP17基因氨基酸序列進行相似度比較（圖2），與西方蜜蜂（A. mellifera，NP_001035297.1）的相似度高達100.00%， 其

余依次為金小蜂（Nasonia vitripennis，CCD17786.1）21.74%、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera，AFI57166.1）20.59%、煙夜蛾（Helicoverpa assulta，AGC92792.1）20.59%、擬谷盜（Tribolium castaneum，EFA02861.1）13.42%、刺舌蠅（Glossina morsitans morsitans，EFA02861.1）11.10%。

2.2東方蜜蜂OBP17基因氨基酸的理化性質

利用ExPASy服務器分析中華蜜蜂OBP17基因蛋白的理化性質，其共有135個氨基酸，分子式為C656H1078N168O210S11、分子量15 031.4、理論等電點4.54、估計半衰期30 h、不穩(wěn)定

指數(shù)28.71（為穩(wěn)定蛋白）、脂肪指數(shù)111.19、親水指數(shù) 0.146。使用ProtScal程序在線分析東方蜜蜂OBP17基因的疏水性（圖3），疏水性指數(shù)的最大值、最小值分別為3.322、-2.256，由此推測中華蜜蜂OBP17基因蛋白為疏水性蛋白。使用PSIPRED v3.0程序分析東方蜜蜂OBP17基因蛋白的二級結構，預測結果表明OBP17基因沒有β-折疊，屬于全α型蛋白。

2.3東方蜜蜂OBP17基因的蛋白序列信號肽及蛋白質跨膜區(qū)域預測

使用SignalP-4.1程序[15]在線分析東方蜜蜂OBP17基因的信號肽，結果（圖4）顯示，東方蜜蜂OBP17基因具有信號肽，最可能的剪切位點預測在第16位點至第17位點間，成熟蛋白啟動的位置為17，預測信號肽的長度為第1位點至第16位點氨基酸。使用TMHMM service 2.0程序在線分析東方蜜蜂OBP17基因的跨膜區(qū)，并未發(fā)現(xiàn)OBP17基因具有跨膜區(qū)。

2.4OBP17基因在不同抗螨性能蜂群中的表達

對蜂螨脅迫處理組、蜂螨抗性對照組、蜂螨敏感性對照組的中華蜜蜂頭部組織中OBP17基因的表達水平進行比較分析。蜂螨抗性對照組的樣品命名為C，受蜂螨脅迫24 h的樣品命名為C+；蜂螨易感對照組的樣品命名為M，受蜂螨脅迫

24 h的樣品命名為M+。結果（圖5）表明，在蜂螨脅迫下的抗性群體頭部組織中，OBP17基因的表達量顯著高于未受脅迫的抗性群體和受同等蜂螨脅迫的敏感性群體，可見中華蜜蜂OBP17基因的表達變化與蜂螨感染過程相關，說明OBP17基因可能在中華蜜蜂的抗螨行為中起重要作用。

3結論與討論

本試驗以中華蜜蜂頭部組織為材料，克隆出OBP17基因完整CDS序列，采用生物信息學方法對序列及其編碼的蛋白質進行分析和預測。結果表明，OBP17基因CDS序列全長為408 bp，編碼135個氨基酸；將該基因CDS區(qū)與GenBank中其他昆蟲綱的同源基因進行比對，發(fā)現(xiàn)其與西方蜜蜂（NP_001035297.1）的同源性高達100%，充分體現(xiàn)了2個物種的近緣關系，同時表明氣味結合蛋白在這2個物種間高度保守，其功能很可能相似。對OBP17基因蛋白氨基酸序列進行分析和功能預測，顯示其為分泌性疏水蛋白，無跨膜結構，這與氣味結合蛋白轉運氣味分子的功能相符合，并證明試驗所克隆序列的正確性。

嗅覺敏感性差異是導致蜜蜂抗螨性狀差異的重要原因[16-18]，而氣味結合蛋白OBPs對蜜蜂感受外界氣味起重要作用。OBPs與脂溶性氣味分子發(fā)生的作用，是昆蟲專一性識別外界氣味物質所發(fā)生的第1步生化反應[6]。經(jīng)RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，OBP17基因在蜂螨脅迫下的抗性東方蜜蜂中高度表達，而在未受蜂螨脅迫的抗性群體及敏感性群體中表達量很低，可見OBP17基因在中華蜜蜂的抗螨過程中起重要作用。目前，梳理行為、衛(wèi)生行為是最普遍接受的蜜蜂抗螨機制。很多研究表明，具有抗螨性狀的蜜蜂能夠發(fā)現(xiàn)、抓住、撕咬正在移動的蜂螨，梳理自己和同伴身上的蜂螨，還可檢查房內已被病害感染的蜜蜂幼蟲，咬開封蓋房并清除感染幼蟲[9，19-20]。蜂箱內為暗環(huán)境，蜜蜂很可能通過有效識別蜂螨的特殊氣味（螨害體表表皮碳氫化合物）而將其清除[21]。由此推測，蜂螨抗性群體、敏感性群體對蜂螨氣味的敏感度差異造成了其蜂螨抗性的差異，而OBP17基因可能在此過程中起重要作用。本試驗的推測尚須進一步研究加以論證。

參考文獻：

[1]Pelosi P. Perireceptor events in olfaction[J]. Journal of Neurobiology，1996，30（1）：3-19.

[2]李紅亮，聶文敏，高其康，等. 中華蜜蜂氣味結合蛋白ASP2 cDNA的克隆及原核表達[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（3）：933-938.

[3]李紅亮，張林雅，莊樹林，等. 中華蜜蜂普通氣味結合蛋白ASP2的氣味結合功能模式分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46（1）：154-161.

[4]張小輝，朱忠珂，祁艷霞，等. 中華蜜蜂氣味結合蛋白5，9，11，12基因克隆及生物信息學分析[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，4（7）：140-141.

[5]陳楊，余林生，申潔瓊，等. 具有不同抗螨特性的東方蜜蜂 cDNA 文庫構建和CSP3基因CDs序列分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（2）：21-24.

[6]Foret S M R. Evolution of a gene family encoding odorant binding-like proteins in a social insect：the honey bee（Apis mellifera）[J]. Genome Research，2006，16（11）：1404-1413.

[7]Behrens D，Huang Q，Gessner C，et al. Three QTL in the honey bee Apis mellifera L. suppress reproduction of the parasitic mite Varroa destructor[J]. Ecology and Evolution，2011，1（4）：451-458.

[8]黃雙修，周婷，姚軍，等. 對中華蜜蜂寄生瓦螨生物學和分類地位及中蜂抗螨機制的新認識（一）[J]. 蜜蜂雜志，2003（1）：10-11.

[9]譚墾，余玉生，張學文，等. 東方蜜蜂抗螨的試驗研究[J]. 中國養(yǎng)蜂，2002，53（6）：10-12.

[10]周婷. 狄斯瓦螨的生物學特性及在我國的自然分布[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2005.

[11]Swanson J A，Torto B，Kells S A，et al. Odorants that induce hygienic behavior in honeybees：identification of volatile compounds in chalkbrood-infected honeybee larvae[J]. Journal of Chemical Ecology，2009，35（9）：1108-1116.

[12]Martin C，Provost E，Roux M，et al. Resistance of the honey bee，Apis mellifera to the acarian parasite Varroa destructor：behavioural and electroantennographic data[J]. Physiological Entomology，2001，26（4）：362-370.

[13]Navajas M，Migeon A，Alaux C，et al. Differential gene expression of the honey bee Apis mellifera associated with Varroa destructor infection[J]. BMC Genomics，2008，9：301.

[14]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） Method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[15]Petersen T N，Brunak S，Von H G，et al. SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods，2011，8（10）：785-786.

[16]Gramacho K P，Spivak M. Differences in olfactory sensitivity and behavioral responses among honey bees bred for hygienic behavior[J]. Behavioral Ecology and Sociobiology，2003，54（5）：472-479.

[17]Carcaud J，Hill T，Giurfa M，et al. Differential coding by two olfactory subsystems in the honeybee brain[J]. Journal of Neurophysiology，2012，108（4）：1106-1121.

[18]Yang E C，Chang H C，Wu W Y，et al. Impaired olfactory associative behavior of honeybee workers due to contamination of imidacloprid in the larval stage[J]. PLoS One，2012，7（11）：e49472.

[19]Thakur R K，Bienefeld K，Keller R. Varroa defense behavior in Apis mellifera carnica[J]. American Bee Journa，1997，137：143-148.

[20]Aumeier P. Bioassay for grooming effectiveness towards Varroa destructor mites in Africanized and Carniolan honey bees[J]. Apidologie，2001，32：81-90.

[21]Boecking O，Genersch E. Varroosis-the ongoing crisis in bee keeping[J]. Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit，2008，3（2）：221-228.張明，呂明，李瑞文，等. MRFs家族基因在鯉魚紅肌和白肌中的表達差異[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（11）：49-51.