小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意義的研究①

項(xiàng)亮亮，侯　杰，王　婕，焦成斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科，黑龍江 佳木斯 154003)

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小鼠肝癌原位移植模型的建立及其意義的研究①

項(xiàng)亮亮，侯杰，王婕，焦成斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外二科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：探討用肝癌H22細(xì)胞建立小鼠肝癌原位移植模型。方法：將肝癌H22細(xì)胞注入小鼠腹腔內(nèi)，建立異位移植模型；抽取腹水中癌細(xì)胞接種于小鼠肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，建立原位移植模型。結(jié)果：移植后10d可捫及腫瘤生長，模型成功率94.4%；晚期自發(fā)轉(zhuǎn)移率79.4%，腹水產(chǎn)生率35.3%，無自發(fā)消退；移植瘤保持甲胎蛋白(AFP)、異常凝血酶原(DCP)高分泌及γ-氨基酰轉(zhuǎn)氨酶(γ-GT)同工酶陽性的特點(diǎn)；模型平均自然生存期28d。結(jié)論：小鼠肝癌原位模型成功率高，易于制作，生物學(xué)特征符合模擬人類肝癌在體內(nèi)發(fā)生發(fā)展的全過程，可成為今后人類研究肝癌的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

關(guān)鍵詞：肝癌；H22細(xì)胞；原位移植模型；小鼠

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，因其發(fā)病率高、惡性程度高、死亡率高，素有“癌中之王”的稱號(hào)[1]。目前已有大量研究為肝癌臨床的治療提供基礎(chǔ)依據(jù)，而肝癌動(dòng)物模型一直是肝癌臨床與基礎(chǔ)研究工作的重要工具。目前有關(guān)人腫瘤轉(zhuǎn)移模型大多是用裸大鼠、裸小鼠,動(dòng)物腫瘤則多數(shù)是用Wistar或SD大鼠建立的,而用小鼠建立原位腫瘤移植模型國內(nèi)外報(bào)道較少。小鼠作為一種更經(jīng)濟(jì)，易飼養(yǎng)，易獲得的實(shí)驗(yàn)研究載體，在發(fā)揮其普遍應(yīng)用性方面有著重大的作用。小鼠肝癌原位移植模型作為一種新型的動(dòng)物模型是否能更好地模擬人肝癌在體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程，本實(shí)驗(yàn)將研究報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及瘤株

SPF級(jí)昆明小鼠40只，雄性，鼠齡5周齡，體重約18~22g；腹水型肝癌H22細(xì)胞株，由佳木斯大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室代為凍存。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及材料

臺(tái)式低溫高速離心機(jī)、切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡、游標(biāo)卡尺、電子精密天平、無菌操作臺(tái)、10%福爾馬林固定液、水合氯醛、伊紅、蘇木素、瓊脂糖等。

1.3模型制作

1.3.1異位模型制作：將凍存的肝癌H22細(xì)胞株復(fù)蘇，體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，以生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL,每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.5mL，共4只。注射7d后在無菌條件下抽出腹水，離心,去除雜質(zhì)細(xì)胞，調(diào)整癌細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL備用，進(jìn)行原位移植[2]。

1.3.2原位模型制作：采取開腹手術(shù)直接注入肝臟法。昆明小鼠共36只。(1)取5周齡小鼠，抓取固定，腹部剃毛，75%醫(yī)用酒精消毒，按小鼠體重的0.3%比例行水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉起效后，將小鼠四肢固定小手術(shù)臺(tái)上，腹部再次消毒，取劍突下上腹部正中切口，長約1.2cm，剪開皮膚、腹白線及腹膜，壓迫止血，輕輕擠壓小鼠雙側(cè)腹壁，將小鼠肝左葉擠壓出腹腔。(2)取無菌注射器將0.1mLH22腫瘤細(xì)胞注入左肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，退出針頭，輕壓針眼，取燒紅的鐵絲輕灼針眼，防止腫瘤細(xì)胞逃逸，發(fā)生腹腔種植，將肝左葉輕輕送回腹腔。(3)查無活動(dòng)性出血，取1號(hào)絲線縫合腹壁各層，消毒，小創(chuàng)口貼切口黏貼，結(jié)束造模。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1模型觀察：定期觀察荷瘤小鼠生存、活動(dòng)狀況及腹部體征。捫查腹部了解移植瘤形成時(shí)間、質(zhì)地及大小，以小鼠腹部可觸及實(shí)體性包塊為成瘤標(biāo)志。留取10只荷瘤小鼠觀察其帶瘤的自然生存期。

1.4.2解剖學(xué)及病理學(xué)觀察：當(dāng)小鼠出現(xiàn)消瘦、精神萎靡等體征時(shí)處死小鼠。開腹肉眼觀察腫瘤生長部位、質(zhì)地、活動(dòng)度、浸潤、腹水及腹腔轉(zhuǎn)移情況。游標(biāo)卡尺測量瘤體的長(l)、寬(w)、高(h)，體積(v)= π(l×w×h)/6計(jì)算[3，4]。10%福爾馬林液固定瘤體，石蠟包埋，切片，經(jīng)HE染色作常規(guī)病理檢查。

1.4.3血清學(xué)檢測：小鼠處死前，采用眼球摘除法取血，及時(shí)分離血清。ELISA法檢測AFP[5]、DCP[6]，γ-GTⅡ檢測用聚丙烯酰胺凝膠梯度電泳法分離，凡出現(xiàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶任一條即可判定結(jié)果陽性[7]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包，計(jì)量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果

2.1造模情況

模型成功率達(dá)94.4%(34/36)。移植5d左右小鼠皮膚傷口愈合。10d左右中上腹可捫及直徑約0.4～0.6cm，位置固定、質(zhì)地稍軟的實(shí)體腫塊。14d可捫及較明顯的腫塊，隨后腫瘤生長速度增快，腫瘤大小略有差異。21d瘤徑達(dá)2.0cm左右，可見腹部膨隆，部分小鼠出現(xiàn)消瘦、精神萎靡、行動(dòng)遲緩等現(xiàn)象。模型平均自然生存期28d。

2.2大體解剖觀察

移植瘤形態(tài)相對(duì)規(guī)則，成圓形或橢圓形，大部分暗紅色，局部為白色，實(shí)質(zhì)性，質(zhì)較硬，與周圍肝組織間完全或部分包膜包繞，表面有大小不等的結(jié)節(jié)，以浸潤性生長為主，見圖1。21d原位模型移植瘤平均體積(664.28±72.63)mm3，平均重量(1.54±0.23)g，晚期出現(xiàn)肝內(nèi)、皮下及腸系膜腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率79.4%(27/34)，大量腹水占35.3%(12/34)。

圖1　移植21d后腫瘤大小(構(gòu)2.0cm)

2.3病理組織觀察

HE染色光鏡下觀察癌細(xì)胞表面不規(guī)則，分化程度差，核大成圓形，深染，核質(zhì)比大，游離核糖體增多等；腫瘤邊緣浸潤肝組織，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)可見大量癌細(xì)胞，排列緊密，見圖2。

圖2　腫瘤組織病理切片(HE×400)

2.4血清AFP、DCP及γ-GTⅡ檢測

移植瘤保持了癌細(xì)胞分泌AFP、DCP，γ-GT的特點(diǎn)，且γ-GTⅡ檢測均為陽性。

3　討論

肝癌動(dòng)物模型的建立包括誘發(fā)性、轉(zhuǎn)基因及移植型，移植型又包括異位移植型及原位移植型。前兩種動(dòng)物模型由于自發(fā)性肝癌發(fā)病率低且模型穩(wěn)定率差、病變的發(fā)生時(shí)間較難預(yù)測，且成本高、模型成功率低、癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)特征常多樣，所以具有一定的研究局限性[8]。異位移植模型雖能維持來源腫瘤的組織結(jié)構(gòu)及生物特性，但很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而影響了在研究人類腫瘤轉(zhuǎn)移特性方面的價(jià)值。原位移植是二十世紀(jì)八十年代逐漸發(fā)展起來的一種移植方式，與異位移植相比可以更好地再現(xiàn)臨床腫瘤在人體內(nèi)發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的全過程[9]。我們利用移植經(jīng)腹水傳代的H22腫瘤細(xì)胞成功的建立了小鼠肝癌原位移植模型，制模周期短、成本低，成功率高達(dá)94.4%，轉(zhuǎn)移率為79.4%，且降低了早期腹水的發(fā)生率，晚期大量腹水占35.3%，未發(fā)現(xiàn)自發(fā)性消退，還保持了絕大多數(shù)的生物學(xué)特性，包括腫瘤的組織結(jié)構(gòu)，AFP、DCP高分泌與γ-GTⅡ陽性的特點(diǎn)，基本模擬了人類肝癌的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的自然過程，適用于對(duì)肝癌的藥物治療及侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制方面的研究。本實(shí)驗(yàn)表明，小鼠肝癌原位移植模型可成為今后人類研究肝癌的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虺晒⑿∈蟾伟┰灰浦材Ｐ筒l(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的主要原因歸結(jié)于以下幾方面:(1)精確的麻醉技術(shù)和熟練的手術(shù)技巧是減少小鼠因過麻死或手術(shù)出血過多而死亡的關(guān)鍵，更是模型成功的重中之重；(2)嚴(yán)格無菌操作，防止因感染造成小鼠死亡影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(3)利用自身的腹水提取癌細(xì)胞，其性質(zhì)穩(wěn)定，異質(zhì)性小，直接接種于原位環(huán)境更有利于在體內(nèi)生長；(4)接種鼠在性別選擇上，盡量為雄性小鼠，以防激素依賴性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；(5)在小鼠體重選擇上，以18~22g為宜，體重過輕則因肝臟過小增加手術(shù)難度，反之增加肝臟的排斥反應(yīng)影響移植瘤的生長；(6)癌細(xì)胞本身具有較強(qiáng)的惡性行為表達(dá)能力；(7)開腹直接接種腫瘤細(xì)胞，用燒紅的鐵絲輕灼針眼，減少術(shù)中出血，防止腫瘤細(xì)胞逃逸等造成腹腔種植及早期腹水的形成。

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中圖分類號(hào)：R735.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0048-02

基金項(xiàng)目：①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào):LM2014-018。

作者簡介：項(xiàng)亮亮(1989～)男，安徽安慶人，在讀碩士研究生。

通訊作者：焦成斌(1965～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:JiaoChengBin2009@sina.com。

(收稿日期：2015-06-06)