堿性納米羥基磷灰石根充糊劑抑菌性的實驗研究①

韓俊玲，王健平，張　艷，王佳琦

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

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堿性納米羥基磷灰石根充糊劑抑菌性的實驗研究①

韓俊玲，王健平，張艷，王佳琦

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

摘要：目的：將不同堿性pH值納米羥基磷灰石粉末，按比例經(jīng)生理鹽水調(diào)制成糊劑，體外研究這種根充糊劑對根管內(nèi)常見致病菌(白色念珠菌，糞腸球菌)的抑制作用。方法：應(yīng)用瓊脂擴散法(ADT)針對白色念珠菌及糞腸球菌這兩類根管常見致病菌，評價pH=10納米羥基磷灰石糊劑，pH=11納米羥基磷灰石糊劑，pH=12納米羥基磷灰石糊劑對其的體外抑制作用，對照組采用的是VITAPEX根充糊劑及氫氧化鈣糊劑。結(jié)果及結(jié)論：VITAPEX根充糊劑，氫氧化鈣糊劑，pH=12納米羥基磷灰石糊劑對白色念珠菌、糞腸球菌均有抑制作用。pH=10，pH=11納米羥基磷灰石糊劑對白色念珠菌、糞腸球菌沒有抑制作用。VITAPEX、pH=12納米羥基磷灰石糊劑對白色念珠菌的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，VITAPEX根充糊劑對糞腸球菌的抑制作用優(yōu)于pH=12納米羥基磷灰石糊劑(P<0.05)。氫氧化鈣糊劑對白色念珠菌、糞腸球菌的抑制作用優(yōu)于pH=12納米羥基磷灰石糊劑(P<0.05)。pH=12納米羥基磷灰石糊劑對糞腸球菌及白色念珠菌的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

關(guān)鍵詞：納米羥基磷灰石；白色念珠菌；糞腸球菌；抑菌性

齲病、牙髓病、根尖周病是口腔內(nèi)科臨床上最容易接觸到的三大類疾病，由多種因素相互作用而成，其中細菌因素被認為是其主要致病因素。根管治療術(shù)(RCT)是治療這兩類疾病最有效最徹底的方法，但人為的根管預(yù)備很難將根管系統(tǒng)的每一個角落都處理到，副側(cè)管的存在為我們的治療增加了難度，此時根管充填中的根充糊劑起到了很大的作用。目前臨床上所應(yīng)用的根充糊劑類其抑菌作用有限，很難達到長期的效果，因此我們還應(yīng)尋找更為有效的根充糊劑。納米羥基磷灰石是一種具有生物相容性、骨誘導(dǎo)性等特性的新型材料，其存在的生物特性使其作為一種新型材料應(yīng)用于口腔臨床多個學(xué)科。在制作納米羥基磷灰石的過程中可根據(jù)需要調(diào)整其pH值，研究證實不同pH值可表現(xiàn)在n-HA純度跟顆粒細度的不同，隨著pH值的增大，其純度也逐漸增大，顆粒則越來越小。對納米羥基磷灰石作為根充糊劑的研究較多，但對其不同pH值的研究較少，故本實驗將在此方面進行研究，以求尋找一種更好的。

1　材料及方法

1.1材料

糞腸球菌、白色念珠菌、不同pH值納米羥基磷灰石、生理鹽水、腦心浸液瓊脂(BHI))、腦心浸出液肉湯(BHI)、沙氏培養(yǎng)基、無菌培養(yǎng)皿、氫氧化鈣糊劑、VITAPEX根充糊劑等。

1.2儀器

恒溫培養(yǎng)箱、凈化工作臺、電子天平、無菌打孔器、游標卡尺、接種環(huán)、無菌棉捻子、酒精燈等。

1.3試驗方法及步驟

1.3.1實驗分組

A.pH=10 納米羥基磷灰石糊劑(pH=10 納米羥基磷灰石與生理鹽水調(diào)成糊劑)；B.pH=11 納米羥基磷灰石糊劑( pH=11 納米羥基磷灰石與生理鹽水調(diào)成糊劑)；C.pH=12 納米羥基磷灰石糊劑(pH=12 納米羥基磷灰石與生理鹽水調(diào)成糊劑)；D．vitapex根充糊劑；E．氫氧化鈣糊劑。

1.3.2實驗方法步驟

實驗菌懸液的獲取 將實驗所用的糞腸球菌、白色念珠菌標準菌株經(jīng)BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)復(fù)蘇后，接種于BHI固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿封好后放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，即取得第一代菌種。從培養(yǎng)皿上用無菌接種環(huán)調(diào)取24h純培養(yǎng)物(最好為單個小菌落)并接種于BHI液體培養(yǎng)基，封好口后放置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24h，矯正菌液濃度0.5McFarland(每毫升1×108個細菌)以備后續(xù)使用。根據(jù)瓊脂擴散法的方法用無菌打孔器(直徑6mm)打孔，在每個培養(yǎng)基的中間打一個孔，大小為6mm×6mm，并保證孔的底部有瓊脂封底。用無菌棉捻子沾取矯正好的糞腸球菌菌液接種于打好孔的BHI瓊脂培養(yǎng)基，白色念珠菌菌液接種于打好孔的沙氏培養(yǎng)基，在接種時應(yīng)注意在培養(yǎng)基表面均勻涂抹，并且不要用力過大破壞培養(yǎng)基，最后將棉捻子繞平板外緣涂抹一周，將平板放置在室溫環(huán)境中干燥并吸收菌液5min。

抑菌環(huán)直徑的獲取 將按比例新鮮調(diào)制的實驗糊劑放入相應(yīng)的孔內(nèi)，注意放入糊劑時不可超出孔外，將培養(yǎng)基封好并放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，在顯微鏡下用游標卡尺“十”測量并記錄抑菌環(huán)的直徑，每個標本重復(fù)多做幾例，做好標記，經(jīng)測量記錄結(jié)果，用統(tǒng)計學(xué)軟件進行方差分析。

2　結(jié)果

VITAPEX根充糊劑，氫氧化鈣糊劑，pH=12納米羥基磷灰石糊劑對白色念珠菌、糞腸球菌均有抑制作用。pH=10，pH=11納米羥基磷灰石糊劑對白色念珠菌、糞腸球菌沒有抑制作用。VITAPEX、pH=12納米羥基磷灰石糊劑對白色念珠菌的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，VITAPEX根充糊劑對糞腸球菌的抑制作用優(yōu)于pH=12納米羥基磷灰石糊劑(P<0.05)。氫氧化鈣糊劑對白色念珠菌、糞腸球菌的抑制作用優(yōu)于pH=12納米羥基磷灰石糊劑(P<0.05)。pH=12納米羥基磷灰石糊劑對糞腸球菌及白色念珠菌的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　實驗所得數(shù)據(jù)

分 組白色念珠菌糞腸球菌pH=10n-HA糊劑6.00±0.006.00±0.00pH=11n-HA糊劑6.00±0.006.00±0.00pH=12n-HA糊劑10.83±1.2612.33±0.58VITAPEX根充糊劑12.33±0.7614.84±0.29氫氧化鈣糊劑19.67±1.5224.83±0.76

(因抑菌環(huán)直徑包括中間所打孔的直徑，孔的直徑為6㎜，pH=10，pH=11納米羥基磷灰石糊劑對細菌沒有抑制作用，所以只有中間孔的直徑，為6㎜)

3　討論

多項研究表明導(dǎo)致牙髓病根尖周病的主要原因是細菌感染[1],細菌能夠?qū)е卵浪韪腥局饕怯捎谄湓诟軆?nèi)以生物膜形式存在[2]，細菌與其所形成的生物膜在根管內(nèi)形成根管微生態(tài)系統(tǒng)，不僅能夠有效的抵抗來自宿主的免疫反應(yīng)，還不能經(jīng)根管治療輕易去除。經(jīng)器械進行根管預(yù)備、藥物等進行根管消毒后，根管內(nèi)殘留細菌的進一步消除，這有賴于根管充填所用根充糊劑本身的作用，使其不僅應(yīng)具有嚴密的根尖封閉性能、對根尖周組織無毒無刺激性，還能發(fā)揮緩慢而持續(xù)的消毒作用，以提高根管治療的成功率[3]。

多數(shù)學(xué)者經(jīng)研究證明導(dǎo)致根管繼發(fā)性感染或持續(xù)性感染的主要致病菌為糞腸球菌及白色念珠菌[4]，白色念珠菌與糞腸球菌同時存在于根管的牙本質(zhì)小管中，對多種根管消毒藥物有抵抗作用，尤其是可長期饑餓生存的糞腸球菌。故本實驗選取這兩種菌作為實驗菌進行實驗研究。

氫氧化鈣糊劑現(xiàn)如今作為一種臨床上常用的根管消毒劑，能對細菌產(chǎn)生抑制作用主要是因其具有強堿性(pH=12.5~12.8)，能影響菌體細胞膜的帶電荷性質(zhì)和穩(wěn)定性，還能促使細菌細胞膜上的蛋白發(fā)生變性，影響細胞膜的通透性而使其死亡；其次是因為OH-可以同細菌的DNA發(fā)生反應(yīng)，誘導(dǎo)其雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解螺旋，從而造成遺傳信息的丟失，進而影響細菌的DNA復(fù)制。但氫氧化鈣糊劑封閉性能稍差，容易吸收強度也不夠，還容易造成根折，沒有阻射性，根充后不能確切顯示根充狀態(tài)，所以現(xiàn)今很少作為根沖糊劑使用。

VITAPEX是一種新型的根管充填材料[5]，本實驗應(yīng)用的VITAPEX的成分為氫氧化鈣，碘仿，羧甲基纖維素鈉鹽，基甲基硅烷和橄欖油。使這種材料不僅擁有氫氧化鈣的功能，還具有碘仿的消毒防腐和殺菌作用。

研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)經(jīng)生物礦化的羥基磷灰石其結(jié)構(gòu)顯為納米結(jié)構(gòu)。經(jīng)人工合成的納米羥基磷灰石顆粒大小介于1~100之間，比一般生物體內(nèi)的細胞都小，其成分和結(jié)構(gòu)與天然骨又具有相似性，還具有優(yōu)良的生物相容性、骨誘導(dǎo)性，同時還是一種生物可降解的材料[6，7]。Webster[8]等發(fā)現(xiàn)，納米粒子可增加破骨細胞的活性，這表明納米級納米羥基磷灰石粒子的表面生物活性可能更有利于新骨的形成和改建。此外該材料所具的骨誘導(dǎo)性可使其超出根尖孔部分與根尖周組織接觸，并通過一定過程修復(fù)根尖周骨質(zhì)破壞。這將不僅有利于減輕材料本身對根尖周組織化學(xué)刺激，有利于根尖周炎癥的恢復(fù)，更有可能形成骨質(zhì)從而促進根尖孔的封閉，因此將其用于根管治療有一定的生物學(xué)基礎(chǔ)。經(jīng)實驗研究顯示生成納米羥基磷灰石晶體較好的溶液酸堿度應(yīng)控制在10~12之間[9]，故本實驗選取這三個pH值做試驗研究。納米羥基磷灰石本身并沒有抑菌性，納米羥基磷灰石糊劑有抑菌作用也不是依靠納米羥基磷灰石，而是有賴于其添加物，如碘仿。但納米羥基磷灰石所具有的納米級擁有不同于大顆粒羥基磷灰石的獨特特性，納米級羥基磷灰石能通過大量吸附與細菌代謝相關(guān)的酶來干擾細菌的代謝[10]，這為n-HA在抑菌過程中起一定作用提供了理論基礎(chǔ)。本實驗采用的是純的納米羥基磷灰石，經(jīng)生理鹽水調(diào)制成糊劑，因此結(jié)果顯示pH=10、pH=11的納米羥基磷灰石并沒有抑菌效果，而pH=12的納米羥基磷灰石是靠其強堿性產(chǎn)生抑菌性，雖然結(jié)果顯示其抑菌性不及氫氧化鈣糊劑，也不及成品vitapex,但真正的根充糊劑由多種成分組成，將何種成分混入納米羥基磷灰石糊劑中增加其抑菌效果，使其更有利于根管治療的成功將需我們進一步實驗研究。

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中圖分類號：R783.1

The bacteriostatic experimental study about the root canal filling
paste-Alkaline nano hydroxyapatite (n-HA)

HANJun-ling,WANGJian-ping,ZHANGYan,WANGJia-qi

(The Second Affiliated Hospitai of Jimusi University, Jiamusi 154002,China)

Abstract:Objective: This experiment aims to mix nano-hydroxyapatite powders with different alkaline pH and moderate amount of normal saline to form a paste and study the inhibition effect of root canal filling paste on common pathogenic bacteria in root canal (Candida albicans and Enterococcus faecalis). Methods: By using the agar diffusion method (ADT) for the root of Candida albicans and Enterococcus faecalis-tube common pathogenic bacteria, we can evaluate the inhibition effect on nano hydroxyapatite past of 10 pH,11 pH and 12 pH, while the comparative group were used Vitapex root canal filling paste and calcium hydroxide paste. Results and conclusion: Vitapex root canal filling paste, calcium hydroxide paste, nano hydroxyapatite paste of 12 pH all have inhibition effects on Candida albicans, Enterococcus faecalis. Nano hydroxyapatite paste of 10 and 11 pH have no inhibition effect. Vitapex and nano hydroxyapatite paste of 12 pH's inhibition effects on Candida albicans don't have statistical significance (P>0.05). The inhibition effect of Vitapex root canal filling paste on Enterococcus faecalis was better than that of nano hydroxyapatite paste of 12 pH (P<0.05).The inhibiting effect of Calcium hydroxide paste paste on Candida albicans、Enterococcus faecalis are better than nano hydroxyapatite paste of 12 pH(P<0.05). Nano hydroxyapatite paste of 12 PH's inhibition effects on Enterococcus faecalis and Candida albicans don't have statistical significance (P>0.05).

Key words:nano-hydroxyapatite;Candida albicans;Enterococcus faecalis;antibacterial activity

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-0041-02

基金項目：①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目，編號：LM2015-063。

作者簡介：韓俊玲(1989~)女，山東淄博人，在讀碩士研究生。

通訊作者：王健平(1959~)男，黑龍江佳木斯人，碩士，教授。E-mail：yaner_15246483385@163.com。

(收稿日期：2015-09-09)