前列腺癌組織中SOX7及SOX9基因的表達(dá)及意義①

張　新，朱廣斌，張?zhí)煊?，陳國?qiáng)，劉湘彬

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.大慶油田總醫(yī)院，黑龍江 大慶 163001；3.大慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，黑龍江 大慶 163001)

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前列腺癌組織中SOX7及SOX9基因的表達(dá)及意義①

張新1，朱廣斌2，張?zhí)煊?，陳國強(qiáng)2，劉湘彬3

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.大慶油田總醫(yī)院，黑龍江 大慶 163001；3.大慶醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，黑龍江 大慶 163001)

摘要：目的：探討前列腺癌組織中SOX7及SOX9的表達(dá)及意義。方法：采用免疫組化法對(duì)SOX7及SOX9在30例前列腺癌組織及30例前列腺增生組織中的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證，再采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR(RT-QPCR)檢測SOX7及SOX9mRNA在30例前列腺癌組織及10例前列腺增生組織中的相對(duì)定量差異。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組中的SOX7呈現(xiàn)了低表達(dá)，而在對(duì)照組中SOX7的表達(dá)偏高(P<0.05)；SOX9在前列腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在前列腺增生組織中呈現(xiàn)低表達(dá)(P<0.05)。在前列腺癌組織中，SOX7的Ct值相對(duì)SOX9偏高，說明前列腺癌組織中SOX7的表達(dá)量相對(duì)于SOX9低。相比對(duì)照組，SOX7在前列腺癌組織中的相對(duì)定量偏低，而SOX9在前列腺癌組織中的相對(duì)定量偏高。結(jié)論：SOX7與SOX9的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。SOX9的表達(dá)與前列腺癌惡性程度正相關(guān)，SOX7的表達(dá)與前列腺癌惡性程度負(fù)相關(guān)。它們的表達(dá)與年齡無明顯相關(guān)。

關(guān)鍵詞:前列腺癌;SOX7;SOX9

在西方國家，前列腺癌是老年男性發(fā)病率最高的腫瘤之一，死亡率僅次于肺癌，位于第二位[1]。而在我國，前列腺癌的死亡率也在逐年上升。生活習(xí)慣越偏向于西方化，許多傳統(tǒng)飲食能帶來的保護(hù)因素就越低[2]。作為一種基因病變，多種基因分不同步驟參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展階段，如受體HER22、EGFR及E2cadherin表達(dá)出現(xiàn)異常[3]，原癌基因ras、c2myc的激活，抑癌基因P53和Rb等出現(xiàn)失活或突變?cè)谇傲邢侔┲卸嘤邪l(fā)生。SOX7位于人類染色體8p23.1，為Wnt/β-catenin_TCF信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[4]，能編碼30個(gè)氨基酸，是SOX基因F亞族成員之一。SOX7的低表達(dá)與包括原發(fā)性結(jié)腸癌、原發(fā)性腎腫瘤、乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均有關(guān)[5]。SOX9位于17號(hào)染色體長臂上17q24.3-25.1，其HMG-box可以結(jié)合ImPortinβ、CaM[6]，SOX9能編碼509個(gè)氨基酸，是SOX基因E亞族的成員之一。筆者應(yīng)用RT-QPCR及免疫組化評(píng)分對(duì)前列腺癌組織及正常前列腺增生組織中SOX7、SOX9的表達(dá)差異進(jìn)行了檢測，并對(duì)其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系進(jìn)行了分析。

1　材料與方法

1.1材料

2013-03～2014-11由大慶市油田總醫(yī)院、大慶龍南醫(yī)院兩所醫(yī)院泌尿外科經(jīng)直腸前列腺穿刺、手術(shù)切除的30例前列腺癌組織標(biāo)本，30例標(biāo)本經(jīng)過病理診斷證實(shí)為前列腺癌。另選取上述醫(yī)院手術(shù)切除后病理診斷為前列腺增生的標(biāo)本30例為對(duì)照組。標(biāo)本離體后立即取材，半小時(shí)內(nèi)凍存于液氮內(nèi)并保存。

1.2方法

1.2.1免疫組化方法：液氮取出組織后脫水并石蠟包埋，自動(dòng)切片機(jī)連續(xù)切片4μm并展片，按SP試劑盒說明進(jìn)行一抗二抗染色操作。光鏡下每張切片選擇5個(gè)隨機(jī)高倍鏡視野(400×)，胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕色即判定為陽性細(xì)胞。按陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例、陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)判。陰性對(duì)照使用PBS，由兩位病理學(xué)家對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。

1.2.2目標(biāo)基因mRNA檢測：采用Trizol法提取實(shí)驗(yàn)組織總RNA，按照試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并儲(chǔ)存在-20℃冰箱備用。以cDNA為模版，進(jìn)行RT-QPCR擴(kuò)增SOX7、SOX9及內(nèi)參GAPDH基因，引物序列見表1。擴(kuò)增體系由10μLSYBR Green I Master Mix、6.4μL超純水、2μLcDNA、0.8μLPrimer Mix組成。設(shè)置PCR儀的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性60S，95℃變性10S，60℃退火15S，72℃延伸20S，共40個(gè)循環(huán)。SOX7、SOX9的mRNA表達(dá)水平為2- Ct， Ct=Ct(目標(biāo)基因)-Ct(內(nèi)參基因)。

表1　引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1免疫組化結(jié)果

30例前列腺癌組織中SOX7陽性表達(dá)12例，陽性率40%；30例前列腺增生組織中SOX7陽性表達(dá)21例，陽性率70%(χ2=5.455，P <0.05)。30例前列腺癌組織中SOX9陽性表達(dá)28例，陽性率93.3%，30例前列腺增生組織中SOX9陽表達(dá)22例，陽性率73.3%(χ2=4.320，P <0.05)。前列腺癌組織中SOX7表達(dá)明顯低于前列腺增生組織，SOX9在前列腺癌組織中表達(dá)明顯強(qiáng)于前列腺增生組織。

圖1　SOX7染色結(jié)果(400×)，左為前列腺癌組織，右為前列腺增生組織

圖2　SOX9染色結(jié)果(400×)，左為前列腺癌組織，右為前列腺增生組織

2.2SOX7、SOX7染色評(píng)分對(duì)比臨床病理參數(shù)

見表2。

表2　SOX7、SOX9染色評(píng)分與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3SOX7及SOX9mRNA在Pca組織和BPH組織中的表達(dá)

對(duì)SOX7及SOX9在前列腺癌組織及前列腺增生組織中的mRNA表達(dá)量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果可見SOX7在前列腺癌組織中的mRNA表達(dá)量為(2.760±0.908)，而在前列腺增生組織中的表達(dá)量為(4.274±0.874)，差異具有顯著性(P <0.05)。

2.4不同臨床病理參數(shù)Pca組織中SOX7及SOX9mRNA的表達(dá)

見表3。

表3　SOX7、SOX9mRNA表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3　討論

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)中最常見的癌癥。在對(duì)前列腺癌的早期診斷中，血清PSA一直是臨床上廣泛使用的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但在實(shí)際臨床工作中，我們經(jīng)?？梢砸姷叫g(shù)前應(yīng)用PSA評(píng)估病情未達(dá)到前列腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后病理診斷卻證實(shí)為前列腺癌的病例；有些病例是術(shù)前PSA經(jīng)過反復(fù)檢查一直偏高，術(shù)后病理診斷卻是良性前列腺增生。這樣的病例并非偶然，血清PSA的診斷灰區(qū)正在令臨床醫(yī)生變得越來越尷尬。前列腺癌是一種病因尚未明確的復(fù)雜性疾病，目前針對(duì)前列腺癌的治療多種多樣，諸如雄激素抑制治療(Androgen suppression therapy, AST)這樣的治療方法對(duì)于前列腺癌，尤其是轉(zhuǎn)移性前列腺癌，已經(jīng)被公認(rèn)為是最為有效，但幾乎所有經(jīng)過一段時(shí)間AST的患者均會(huì)產(chǎn)生雄激素抵抗，而一旦發(fā)展為AIPC或HRPC，前列腺癌就會(huì)復(fù)發(fā)并變得無法治愈[7]。因此，找到對(duì)前列腺癌早期診斷有幫助，且對(duì)判斷前列腺癌進(jìn)展及預(yù)后有一定提示作用的新的分子標(biāo)志物變得越來越迫切。

根據(jù)先前的研究，在某些人類腫瘤細(xì)胞系中，如宮頸癌Hela S3、結(jié)腸癌SW480等，SOX7并沒有檢測到表達(dá)，進(jìn)而推測SOX7基因在這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能充當(dāng)了抑癌基因的角色[8]。在前列腺癌中，SOX7的mRNA及蛋白表達(dá)均被證實(shí)是下調(diào)的，這在本實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，這種下調(diào)的表達(dá)被認(rèn)為是其特異性啟動(dòng)子甲基化所造成的。 Drivdahl等人[9]在2004年發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌細(xì)胞株中具有較高表達(dá)的SOX9可以導(dǎo)致正常細(xì)胞增殖率的下降，使正常細(xì)胞周期停滯于G0/G1，SOX9同時(shí)還增加了細(xì)胞凋亡的敏感性；Wang等人[10]也表明，在復(fù)發(fā)性激素難治性前列腺癌細(xì)胞中的SOX9呈現(xiàn)更高的表達(dá)；SOX9通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，從而參與了前列腺癌腫瘤重新激活的發(fā)展過程，這些之前的研究都與本次實(shí)驗(yàn)有著相似的結(jié)果。

從本次RT-QPCR結(jié)果中可以看出，SOX7在對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)了明顯的定量差異，在前列腺癌組織中，SOX7的相對(duì)定量偏低，而SOX9與之相反，在前列腺癌組織中呈現(xiàn)了高表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線的Ct值代表了擴(kuò)增所需要的循環(huán)數(shù)，而Ct值與相對(duì)定量成反比，實(shí)驗(yàn)組中SOX9的Ct值相對(duì)SOX7低，相應(yīng)其表達(dá)量就偏高，結(jié)合免疫組化實(shí)驗(yàn)中前列腺癌組織中SOX9蛋白的高表達(dá)，不難看出SOX9可能是促癌基因，它的上調(diào)可能對(duì)前列腺癌的進(jìn)展起了促進(jìn)作用。SOX7可能是抑癌基因，它的下調(diào)也參與了前列腺癌的進(jìn)展。

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The expression of prostate cancer SOX7 and SOX9 gene and its significance

ZHANGXin1,ZHUGuang-bin2,ZHANGTian-yu1,CHENGuo-qiang2,LIUXiang-bin3

(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China; 2.Daqing Oilfield General Hospital, Daqing 163001, China; 3.Daqing Medical College, Daqing 163001, China)

Abstract:Objective:To discuss prostate cancer (prostate cancer, PCa) tissue expression and the significance of SOX7 and SOX9mRNA.Method:Immunohisto chemical method was used to stain the differences of SOX7 and SOX9 expression differences in prostate cancer tissues and 30 cases of benign prostatic hyperplasia verify. Then quantitative real-time reverse transcription PCR (RT-QPCR) and SOX9mRNA SOX7 were used to detect prostate cancer in 30 cases quantitative differences in the relative organization and 10 cases of benign prostatic hyperplasia.Result:SOX7 experimental group presented low expression, while in the control group, the expression of SOX7 was high (P<0.05). SOX9 was highly expressed in prostate cancer tissues, but showing low expression (P<0.05) in benign prostatic hyperplasia. In prostate cancer, compared with SOX7, Ct values of SOX7 was relatively high, indicating that the expression of SOX7 in prostate cancer was low compared with SOX9. Compared to the control group, relative quantification of SOX7 in prostate cancer tissues was low, and relative quantification of SOX9 in prostate cancer tissues was high.Conclusion:SOX7 and SOX9 expression is negatively correlated. SOX9 expression is positively related to the degree of malignancy of prostate cancer. The expression of prostate cancer is negatively correlated to malignancy SOX7. Their expressions were no significant correlation with age.

Key words:prostate cancer ( PCa);SOX7;SOX9

中圖分類號(hào)：R737.25

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0009-03

基金項(xiàng)目：①1.黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題，編號(hào)：2011-398；2.黑龍江省科技廳自然基金面上項(xiàng)目，編號(hào)：D201225。

作者簡介：張新(1987～)男，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，在讀碩士研究生，醫(yī)師。

通訊作者：劉湘彬(1955～)男，黑龍江大慶人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:liuxbin@vip.sina.com。

(收稿日期：2015-03-26)