NGAL在腺嘌呤大鼠腎纖維化中的表達①

康曉明，聶　晶，楊占雙

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003)

?

NGAL在腺嘌呤大鼠腎纖維化中的表達①

康曉明，聶晶，楊占雙

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要:目的：探討NGAL在腺嘌呤致大鼠腎纖維化中的表達情況。方法：將48只Wistar雄性大鼠，隨機分為2組。即正常組(n=24)、模型組(n=24)，模型組每天予以200mg/kg的腺嘌呤灌胃，正常組攝入等量的NS，連續(xù)灌胃6周，在第2、4、6周末將腎組織取出，通過HE染色觀察病理改變，免疫組化染色觀察大鼠腎組織中NGAL的表達情況，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)軟件進行半定量分析。結(jié)果：正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，模型組在第2周時表現(xiàn)管腔擴張，腎小管出現(xiàn)腫脹，腎間質(zhì)有彌漫性炎性細胞浸潤，間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，第4周時腎小管擴張更明顯，腎間質(zhì)仍有較多的炎性細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化較前明顯，第6周時腎小管萎縮甚至有壞死，腎間質(zhì)廣泛纖維化。NGAL在正常對照組大鼠腎組織有少量的表達，尤其以腎小管表達為主，與正常組比較，模型組第2周時腎組織中NGAL的表達水平顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，第4、6周時NGAL的表達水平明顯低于第2周。結(jié)論：NGAL在腺嘌呤所致大鼠腎纖維化的表達水平顯著增高，與對照組比較差異顯著，提示其可作為腎纖維化發(fā)展的指標(biāo)，為臨床上判斷病情提供參考。

關(guān)鍵詞：NGAL；腎纖維化； 表達水平

腎纖維化是各種各樣的慢性腎臟疾病發(fā)展為末期腎病的共同通路，腎臟纖維化作為一種復(fù)雜的疾病，其潛在的分子機制尚不清楚，因此，探討腎纖維化發(fā)展的分子機制對于腎臟疾病的治療，保護殘存腎臟功能意義重大[1~3]。研究表明NGAL在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[4]。此外，最近報道的研究結(jié)果還表明，NGAL可能參與導(dǎo)致慢性腎疾病如多囊腎疾病和腎小球腎炎的病理生理過程[5]。NGAL水平與腎功能損害的嚴重程度明顯相關(guān)，能表示損傷相關(guān)的慢性疾病的程度，但關(guān)于NGAL在腎纖維化組織中的表達情況尚未見報道。在此背景下，本研究通過建立大鼠腎臟纖維化模型，對其腎臟組織NGAL的表達情況及病理變化進行分析以探討腎纖維化發(fā)展的分子機制，以期為臨床更好的治療腎臟系統(tǒng)疾病提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

DAB顯色試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司 )；免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)； 兔抗大鼠NGAL多克隆抗體(沈陽寶信有限公司)。

1.2實驗動物分組及造模

將48只健康清潔的Wistar雄性大鼠隨機分為2組，即正常組24只，模型組24只。模型制作參照相關(guān)文獻[6]并加以改進，采用腺嘌呤200mg/kg灌胃連續(xù)6周，前15d每日灌胃，15d后采用隔日給藥的方式，正常組給予等體積的生理鹽水。

1.3組織標(biāo)本收集、處理與測定

將兩組大鼠處死前一天將其放入代謝籠中以收集24h尿液，收集的尿液與離心機離心后放入-70℃的冰箱中保存待測24h尿蛋白。分別于第2、4、6周末隨機選取大鼠以40mg/kg的戊巴比妥納腹腔注射麻醉后，將大鼠開腹開胸，迅速取出腎臟于4%的多聚甲醛溶液中固定，梯度脫水，從50%乙醇開始，經(jīng)70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇進行逐步脫水，每次時間為30min，其中95%乙醇和無水乙醇進行兩次脫水。再將腎組織先在無水乙醇：二甲苯=1：1的混合液中浸入20min，再于純二甲苯中浸潤10min，再重復(fù)浸入另一瓶二甲苯中浸10min進行適當(dāng)?shù)耐该魈幚恚龠M行石蠟包埋，包埋過程中，石蠟應(yīng)該保持在60℃以下。制成約厚度為3μm的切片進行HE和免疫組化染色。

1.4免疫組化結(jié)果判定

將NGAL的免疫組化染色的切片在光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察免疫組化的結(jié)果，染色呈棕黃色的為免疫組化結(jié)果陽性，取10個不包括腎小球并不重復(fù)的腎間質(zhì)視野，應(yīng)用病理圖像分析系統(tǒng)對陽性結(jié)果進行圖像分析，計算染色為陽性信號的平均積分光密度值(IOD),取平均值進行比較。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1兩組大鼠腎組織病理學(xué)變化

正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常。與正常組比較，模型組在第2周時表現(xiàn)管腔擴張，腎小管出現(xiàn)腫脹，腎間質(zhì)有彌漫性炎性細胞浸潤，間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，第4周時腎小管擴張更明顯，腎間質(zhì)仍有較多的炎性細胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化較前明顯，第6周時腎小管萎縮甚至有壞死，腎間質(zhì)廣泛纖維化。

圖1　正常組大鼠腎組織(HE×400)

圖2　2周模型組腎組織病理變化(HE×400)

圖3　4周模型組腎組織病理變化(HE×400)

圖4　6周模型組腎組織病理變化(HE×400)

2.2各組大鼠腎組織NGAL的表達情況

NGAL在正常對照組大鼠腎組織有少量的表達，尤其以腎小管表達為主，與正常組比較，模型組第2周時腎組織中NGAL的表達水平顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，第4、6周時NGAL的表達水平明顯低于第2周。

表1　各組大鼠腎組織NGAL表達情況

3　討論

慢性腎臟疾病(CKD)發(fā)病機制主要是由于血流動力學(xué)和炎癥過程的相互作用而致，最終會導(dǎo)致腎纖維化。同時腎臟病又是小兒時期的常見病，其病情反復(fù)或遷延會進入腎纖維化時期，嚴重影響患兒的身心健康。其病因多為感染性、免疫性、中毒性、代謝性等因素而導(dǎo)致。腎間質(zhì)纖維化是以間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮及炎癥細胞侵潤為主要病理特征，其發(fā)病機制尚不明確，可能的因素為：腎小管上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，血管活性物質(zhì)、細胞因子和炎癥細胞，和細胞外基質(zhì)的代謝失衡。腎間質(zhì)纖維化的嚴重程度一直是被認定為最強的預(yù)測隨后的進行性腎功能喪失[7]。腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致終末期腎病的慢性腎病的常見表現(xiàn)，此外，腎小管間質(zhì)纖維化是梗阻性腎病的一種重要的結(jié)構(gòu)成分，是導(dǎo)致兒童時期慢性腎病的主要原因，是漸進式的腎臟疾病常見的最后的結(jié)果，它導(dǎo)致重大破壞正常的腎臟結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的功能變差。 早期纖維化的變化，仍可能是可逆的。NGAL是一個25kDa的蛋白質(zhì)，是載脂蛋白家族的一員，于生理狀態(tài)下存在人類組織中包括腎小管上皮細胞中，其表達濃度很低，與腎臟疾病有著密切的關(guān)系。最近，有研究報道，NGAL是作為預(yù)測腎損傷的早期的生物標(biāo)志物。在炎癥存在和上皮細胞受損時，包括腎缺血再灌注損傷和腎毒性NGAL的表達升高。 NGAL在炎癥的反應(yīng)過程中和在腫瘤的進展發(fā)揮了一定的作用，其對腎臟的功能起到有益的作用，能夠靈敏、迅速的反映腎臟疾病的損傷和恢復(fù)的過程。近來越來越多的文獻報道NGAL可能參與了腎間質(zhì)纖維化過程，而且參與腎小管上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，不但可以早期預(yù)測腎間質(zhì)纖維化，同時能夠維持腎小管上皮細胞的表型，阻止其向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。有研究報道，血和尿NGAL水平連續(xù)測量可以預(yù)測系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎病的活動及惡化，血、尿中NGAL水平升高表明狼瘡性腎病的惡化.于永剛[8]等人研究發(fā)現(xiàn)，NGAL在腎間質(zhì)纖維化初期表達顯著升高,隨腎間質(zhì)纖維化進展,NGAL表達水平明顯降低。我們的研究結(jié)果與于永剛等人的研究結(jié)果一致，在腎間質(zhì)纖維化的第2周時NGAL表達升高，第4周時表達降低，第6周時降低更為顯著。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是大鼠機體在連續(xù)灌胃的第4周、6周逐漸適應(yīng)了腺嘌呤灌胃的刺激而發(fā)生NGAL表達水平的降低，也有可能是機體存在一種自動的改善腎纖維化的機制，確切結(jié)果有待進一步研究證實。綜合上述分析我們可以得出結(jié)論，NGAL在腺嘌呤所致大鼠腎纖維化的表達水平顯著增高，與對照組比較差異顯著，提示其可作為腎纖維化發(fā)展的指標(biāo)，為臨床上判斷腎臟纖維化病情嚴重程度提供參考。

參考文獻：

[1]徐小龍,劉丁,劉永光，等.慢性移植腎纖維化診斷的研究進展[J].廣東醫(yī)學(xué), 2014,35(19):3094-3096

[2]李明亮,杜潔.腎纖維化信號通路的研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述, 2013, 19(18):3275-3278

[3]辛冰牧,楊紅振,胡卓偉，等.腎纖維化發(fā)病機制及治療學(xué)研究進展[J].國際藥學(xué)研究雜志, 2008, 35(5):349-354

[4]曾慧勤(綜述),張建江(審校).腎纖維化過程中表觀遺傳因素研究進展[J].國際兒科學(xué)雜志, 2014, (5): 538-541

[5]劉剛,于永剛,梁毅文,等.NGAL在腎間質(zhì)纖維化不同階段的表達及意義[J].浙江臨床醫(yī)學(xué), 2010, 12(5):458-461

[6]劉建春，鄭法雷，劉燕萍,等.褐藻多糖硫酸酯對腺嘌呤致大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及其機制探討[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2008,9(2):100-103

[7]Liu Y.Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis[J]. Nat Rev Nephrol,2011, 7: 684-696

[8]Devarajan P, Mishra J, Supavekin S, et al. Gene expression in early ischemic renal injury: clues towards pathogenesis, biomarker discovery, and novel therapeutics[J].Molecular Genetics and Metabolism, 2003,80(4):36-37

[9]Schmidt-Ott KM, Mori K, Jau YL, et al. Dual action of neutrophil gelatinase-associated lipocalin[J].Journal of the American Society of Nephrology,2007,18(2):407-413

The expression of NGAL on renal interstitial fibrosis

KANGXiao-ming,NIEJing,YANGZhan-shuang

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Abstract：Objective：To evaluate the expression of NGAL in kidney tissue of rats with renal fibrosis. Methods: 48 male Wistar rats were randomly divided into 2 groups: the normal group (n=24) and model group (n=24). Rats in model group were given 200mg/kg adenine everyday, while normal group were given the same amount of NS. The renal tissue was removed on the 2th, 4th, 6th week. Then we observed the pathological changes by HE staining, and evaluated the the expression of NGAL by making a semi-quantitative analysis with an image analysis system software. Result: normal rat renal tissue structure was normal, compared with the normal group. Model group showed luminal dilatation at the second week , the renal tubular swelling, renal interstitial diffuse infiltration of inflammatory cells, interstitial fibrosis. The tubular dilatation was more obvious at the fourth week, renal interstitial still intensive inflammatory cell infiltration, renal interstitial fibrosis significantly. At the sixth week of tubular atrophy and necrosis, renal interstitial extensive fibrosis. NGAL in normal renal tissue of rats had a small amount of expression, particularly in the renal tubules, compared with the normal group. The expression levels of model group at the 2th week were significantly higher (P<0.05). At the 4th and 6th week, NGAL expression levels were significantly lower than those at tthe 2th week. Conclusion: NGAL expression levels in adenine-induced renal fibrosis in rats was significantly higher, and it may suggests that it can be used as indicators for the development of renal fibrosis, and it can provide a reference for judging the clinical condition.

Key words：NGAL; renal fibrosis ; expression levels

中圖分類號：R692

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-000601

基金項目：①1.黑龍江省教育廳科技項目，編號：12541796；2.佳木斯大學(xué)科技項目，編號：S2010-79。

作者簡介：康曉明(1962～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師。

(收稿日期：2015-06-06)