黃芪當(dāng)歸合劑對(duì)梗阻性腎病大鼠E-cadherin和α-SMA表達(dá)的影響①

李　麗 ,王長(zhǎng)山，李懷荊，楊占雙，聶　影，楊　松，聶　晶

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 黑龍江 佳木斯 154007)

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黃芪當(dāng)歸合劑對(duì)梗阻性腎病大鼠E-cadherin和α-SMA表達(dá)的影響①

李麗1,王長(zhǎng)山2，李懷荊2，楊占雙1，聶影1，楊松1，聶晶1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：探討黃芪當(dāng)歸合劑(A&A)在梗阻性腎病中抗纖維化的可能作用機(jī)制。方法: 將30只成年雄性大鼠隨機(jī)分為: 假手術(shù)組( sham 組) 10只,模型組10只(單側(cè)輸尿管結(jié)扎, UUO組)，治療組(A&A組)10只。于術(shù)后14d處死,留取腎組織。光鏡觀察腎臟病理形態(tài)學(xué)改變,采用免疫組化檢測(cè)腎組織E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)。結(jié)果:① HE和Masson染色觀察到UUO組出現(xiàn)明顯的纖維化表現(xiàn);②免疫組化結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組和治療組E-cadherin的下調(diào)伴有α-SMA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，治療組14d E-cadhelin蛋白下降(P<0.05)，E-cadhelin蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)。結(jié)論: 黃芪當(dāng)歸合劑的抗纖維化作用機(jī)制，可能通過(guò)抑制EMT進(jìn)程發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞:腎小管間質(zhì)纖維化; UUO; E-cadherin;α-SMA

梗阻性腎病(obstructive nephropathy)是由泌尿道結(jié)構(gòu)和(或)功能改變，阻礙尿液的排出，導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)病理和功能損害的臨床綜合征。據(jù)統(tǒng)計(jì), 兒童梗阻性腎病占所有終末期腎臟疾病(end-stage renal disease， ESRD)的0.3%，占所有兒童腎移植的16.1%。病理學(xué)特征主要表現(xiàn)為腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腎間質(zhì)纖維化的重要發(fā)病機(jī)制之一[1，2]。單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)制作的梗阻性腎病模型是誘導(dǎo)腎纖維化最經(jīng)典的模型[1，2]。

在腎間質(zhì)纖維化的防治方面, 祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)積累了許多寶貴經(jīng)驗(yàn)[3]，經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí), 具有益氣活血作用的黃芪和當(dāng)歸組方而成的黃芪當(dāng)歸合劑(Astragalus and Angelica, A&A ) 可明顯改善腎臟病的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝紊亂、提高血漿白蛋白；減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β1)的高表達(dá)等不同途徑和環(huán)節(jié)減輕腎間質(zhì)纖維化[4,5]。但關(guān)于A&A在腎間質(zhì)纖維化腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)需通過(guò)建立UUO大鼠模型，探討A&A的治療后，EMT細(xì)胞表型特異性標(biāo)志物E-cadherin和α-SMA的變化情況，了解 A&A在腎間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制，為臨床進(jìn)行腎間質(zhì)纖維化防治提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1模型制備及分組

雄性清潔級(jí)Wistar大鼠30只(由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。以隨機(jī)排列表法隨機(jī)分為：假手術(shù)組(sham組)、模型組(UUO組)和治療組(A&A組)，每組10只，以10%的水合氯醛(300㎎/㎏)腹腔注射麻醉后，行左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左輸尿管，用4-0號(hào)絲線上下結(jié)扎兩處，從中剪斷輸，分層縫合關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組,分離輸尿管不結(jié)扎，隨即縫合腹腔。動(dòng)物清醒1h后，A&A組灌胃給藥(3mL/d，黃芪、當(dāng)歸生藥各0.7g/mL)；sham組和 UUO組給予等量清水[1]。

1.2取材

每組大鼠于術(shù)后14d處死，取左側(cè)腎臟，一部分置4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，待做病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)和免疫組化染色。

1.3病理形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)HE染色，光鏡下觀察腎間質(zhì)纖維化、蛋白管型、腎小管擴(kuò)張和腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度判定腎小管間質(zhì)損傷的程度。每個(gè)參數(shù)分為4個(gè)等級(jí)： 0分為正常，1分為輕度受損，2分為中度受損，3分為重度受損，每個(gè)樣本小管間質(zhì)損傷評(píng)分總分為0~9分。通過(guò)Masson染色，借助圖像分析軟件定量分析腎間質(zhì)纖維化程度。每例切片取10個(gè)不重復(fù)的400倍視野,以藍(lán)色膠原沉積為陽(yáng)性,計(jì)算藍(lán)染面積占整個(gè)視野的百分比，得出腎間質(zhì)膠原面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎小管管腔)的比值,取其平均值為每例切片的腎間質(zhì)相對(duì)面積[1]。

1.4免疫組化檢測(cè)E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)

取腎組織，制備5μm厚連續(xù)切片，按試劑盒操作，一抗E-cadherin和α-SMA。二抗為羊抗兔SP檢測(cè)試劑盒，DAB顯色，陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色。每張切片隨機(jī)取10個(gè)400×高倍視野，陽(yáng)性結(jié)果呈棕黃色或棕褐色顆粒，通過(guò)圖像采集軟件和圖像分析軟件，測(cè)出陽(yáng)性部分平均光密度值，進(jìn)行分析比較。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HE染色

UUO組術(shù)后14 d腎小管結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，腎小管萎縮，腎小管、集合管擴(kuò)張呈囊狀，管腔塌陷，上皮細(xì)胞大量壞死，腎間質(zhì)彌漫性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生及膠原形成。sham組大鼠腎臟腎小管結(jié)構(gòu)正常、排列緊密整齊，間質(zhì)未見(jiàn)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管基底膜光滑完整。兩組腎小管損傷程度評(píng)分比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)[1]。 見(jiàn)表1。

2.2Masson染色

UUO術(shù)后14d可見(jiàn)膠原沉積，腎間質(zhì)逐漸增寬，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分增多；sham組腎臟膠原染色主要位于小管基膜、腎小囊、系膜區(qū)和腎小管間的毛細(xì)血管周圍，而小管周圍間質(zhì)染色較少。UUO組腎間質(zhì)纖維組織相對(duì)面積較sham組明顯增高(P<0.05)[1]，見(jiàn)表1。

表1大鼠腎小管損傷程度評(píng)分和腎間質(zhì)相對(duì)面積比較

腎小管損傷程度腎間質(zhì)相對(duì)面積sham組0.15±0.101.89±0.30UUO組6.12±0.89a32.70±2.51a

aP<0.05與sham組比較。

2.3免疫組化檢測(cè)E-cadherin 蛋白表達(dá)

E-cadherin是上皮細(xì)胞表面標(biāo)志，陽(yáng)性染色鏡下呈棕黃色。sham組腎小管上皮細(xì)胞中可見(jiàn)大量E-cadherin表達(dá)；UUO組術(shù)后14d在腎小管上皮中E-cadherin表達(dá)大量消失，僅見(jiàn)片狀、弱表達(dá)；A&A組在14d在腎小管上皮中E-cadherin表達(dá)部分消失，UUO組與sham組平均密度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；UUO組和A&A組平均密度值的比較(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1],見(jiàn)表2 。

2.4免疫組化檢測(cè)α-SMA蛋白表達(dá)

α-SMA蛋白為細(xì)胞漿染色，陽(yáng)性染色鏡下呈棕黃色。在sham組大鼠腎小球、腎小管以及腎間質(zhì)均未見(jiàn)表達(dá)，僅表達(dá)于腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞。UUO組術(shù)后14d在腎間質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞見(jiàn)較多α-SMA表達(dá)； A&A組14d可見(jiàn)α-SMA，較UUO組表達(dá)量減少。UUO組與sham組平均密度值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；A&A組與UUO組平均光密度值的比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[1],見(jiàn)表2。

表2　免疫組化檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)E-cadherin和α-SMA蛋白的表達(dá)量

aP<0.05，與sham組比較；bP<0.05，UUO組內(nèi)比較。

3　討論

腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程包括腎小管的損傷、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過(guò)多沉積、多個(gè)細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過(guò)程[6]。腎間質(zhì)纖維化(Renal Interstitial Fibrosis， RIF)是梗阻性腎病與其他各種慢性腎病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同通路和重要原因。作為慢性腎功能衰竭的進(jìn)行性發(fā)展過(guò)程中的始動(dòng)因素，RIF被認(rèn)為比腎小球病變更能反映慢性腎功能衰竭的進(jìn)展速率及預(yù)后。RIF的發(fā)病機(jī)制是一復(fù)雜的慢性病理過(guò)程，臨床上缺乏有效、可靠的治療方法，RIF導(dǎo)致的ESRD需依賴透析治療或腎臟移植，為此需要耗費(fèi)巨大的財(cái)力、人力和物力，對(duì)患者、家庭和社會(huì)造成巨大負(fù)擔(dān)。因而阻滯或延緩RIF進(jìn)程是抑制或逆轉(zhuǎn)進(jìn)行性腎功能惡化的關(guān)鍵[1]。

UUO 是誘導(dǎo)腎纖維化最經(jīng)典的模型，劉中柱等亦通過(guò)結(jié)扎大鼠單側(cè)輸尿管建立UUO模型，免疫組化等觀察大鼠腎臟的病理變化[6~9],也有應(yīng)用馬兜鈴酸引起腎病腎間質(zhì)纖維化模型的[10]。在本研究中，通過(guò)HE和Masson染色觀察UUO模型的尿路梗阻后腎臟纖維化表現(xiàn)，腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小管擴(kuò)張、腎間質(zhì)膠原纖維沉積等。證明UUO模型造模成功[1]。

中藥在慢性腎病的治療中具有一定的作用。研究表明，由黃芪和當(dāng)歸組方的黃芪當(dāng)歸合劑通過(guò)抑制ECM 的生成而減輕腎臟纖維化。新近研究發(fā)現(xiàn)A&A 能夠抑制間質(zhì)纖維化腎臟中纖溶酶原激活物抑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1) mRNA 的表達(dá)，提示A&A可能通過(guò)調(diào)控ECM降解，減輕腎臟纖維化[1]，A&A 還能夠下調(diào)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)和纖黏連蛋白(FN)的表達(dá), 抑制腎纖維化[11,12]。但是，對(duì)于A& A 的抗纖維化作用及其機(jī)制目前尚未完全明確。

E-cadherin是腎小管上皮細(xì)胞特征性標(biāo)志，在EMT時(shí)首先消失；α-SMA是肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志性蛋白己得到公認(rèn)[13]。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在腎間質(zhì)纖維化的UUO動(dòng)物模型中存在著E-cadherin表達(dá)的下調(diào)，這與yang等[14]學(xué)者的研究結(jié)果相似。與此同時(shí)，α-SMA蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢(shì)，研究結(jié)果提示，UUO大鼠在腎間質(zhì)纖維化的同時(shí)伴有E-cadherin的下調(diào)和標(biāo)志物α-SMA表達(dá)增加，提示腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生了EMT。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，經(jīng)黃芪當(dāng)歸合劑治療14d E-cadhelin蛋白表達(dá)量較UUO組下降，E-cadhelin蛋白表達(dá)量明顯高于UUO組，這一結(jié)果說(shuō)明黃芪當(dāng)歸合劑可抑制腎小管腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程，延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。提示A&A 的抗纖維化作用機(jī)制，可能通過(guò)抑制EMT進(jìn)程發(fā)揮作用，其具體分子機(jī)制及信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。

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中圖分類號(hào)：R285.6;R691.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0004-02

基金項(xiàng)目：①1.黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：QC2012C119；2.黑龍江省衛(wèi)生廳項(xiàng)目，編號(hào)：2012-198；3.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào)：Sz 2014-011。

作者簡(jiǎn)介:李麗( 1979～ )女,黑龍江佳木斯人,博士,副教授，碩士研究生導(dǎo)師。

通訊作者:王長(zhǎng)山( 1977～ )男,黑龍江佳木斯人,博士，副教授,碩士研究生導(dǎo)師。E- mail: wcs0451@163.com。

(收稿日期：2015-07-08)