刺五加提取物對(duì)睡眠剝奪小鼠抗氧化抗疲勞的研究①

張淑萍，王亞軍，胡春榮，吳成吉，宣兆博，劉文娟，楊利敏，黃作義

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 佳木斯 154003)

?

刺五加提取物對(duì)睡眠剝奪小鼠抗氧化抗疲勞的研究①

張淑萍，王亞軍，胡春榮，吳成吉，宣兆博，劉文娟，楊利敏，黃作義

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的:探討刺五加提取物對(duì)睡眠剝奪小鼠抗氧化的作用及對(duì)抗疲勞的影響。方法:將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、VE對(duì)照組、睡眠剝奪組、刺五加提取物低劑量組(1mg/g·d)、中劑量組(2mg/g·d)、高劑量組(4mg/g·d)。采用小平臺(tái)水環(huán)境法制作大鼠睡眠剝奪模型。觀察小鼠一般狀態(tài)，舌下靜脈取血后測(cè)定血清SOD和MDA的含量。將刺五加提取物灌胃給藥的小鼠進(jìn)行力竭游泳實(shí)驗(yàn)后檢測(cè)血乳酸水平。結(jié)果:與睡眠剝奪組相比，刺五加提取物能夠顯著提高小鼠血清SOD的含量，降低血清MDA的含量，并且降低小鼠運(yùn)動(dòng)后乳酸水平，延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間。結(jié)論:刺五加提取物可以提升小鼠體內(nèi)抗氧化和抗疲勞的能力。

關(guān)鍵詞：睡眠剝奪；刺五加提取物；抗氧化；抗疲勞

睡眠剝奪(sleep deprivation,SD)是指在各種病理或生理狀態(tài)下，因機(jī)體睡眠喪失而引起的一系列臨床癥狀的疾病。隨著生活壓力的逐漸加大，它已成為當(dāng)代社會(huì)的一種普遍現(xiàn)象，長(zhǎng)期的睡眠剝奪會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生重大的影響，且加速機(jī)體的氧化衰老，加重疲勞[1,2]。隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)睡眠剝奪研究的逐漸深入，睡眠剝奪這一現(xiàn)象也逐漸備受重視，但目前關(guān)于刺五加對(duì)睡眠剝奪小鼠的研究報(bào)道甚少。通過(guò)此次研究，我們?cè)噲D探究刺五加提取物對(duì)被睡眠剝奪小鼠的治療效果，為今后睡眠剝奪的治療提供新途徑，為臨床研究做出貢獻(xiàn)。

1　材料與方法

1.1刺五加提取物體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料:UV757CRT 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海玉田分析儀器公司)；HH-S26S型電熱恒溫水浴鍋 (北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；電子天平(常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司)；高速臺(tái)式離心機(jī)(湖南凱達(dá)儀器有限公司)；D-半乳糖(D-Galactose)； 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司))；丙二醛(MDA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；昆明種小鼠 (南京君科生物工程有限公司)；刺五加提取物(西安品誠(chéng)生物科技有限公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型建立:將60只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、睡眠剝奪組、刺五加提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組、維生素E對(duì)照組。根據(jù)參考文獻(xiàn)[3]用D-半乳糖構(gòu)建小鼠衰老模型。根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，采用小平臺(tái)水環(huán)境法，自制鼠箱制造大鼠睡眠剝奪模型[5]。

1.1.3給藥方法：刺五加提取物低、中、高劑量組給藥量分別為1mg/g·d、2mg/g·d、4mg/g·d，維生素E對(duì)照組給予0.05mg/g·d的維生素E灌胃,空白對(duì)照組、睡眠剝奪組用0.02mL/g·d的生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥30d。

1.1.4標(biāo)本的采集及檢測(cè)：觀察小鼠的一般情況(精神，活動(dòng)狀態(tài)，大小便等)，并認(rèn)真記錄各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。記錄完畢后，所有動(dòng)物均于同一時(shí)間內(nèi)對(duì)小鼠進(jìn)行舌下靜脈采血[4]，3500r/min離心10min，取血清，做好標(biāo)記，-20℃保存待測(cè)。用紫外分光光度法檢測(cè)小鼠血清中MDA和SOD的含量(按照試劑盒說(shuō)明)。

1.1.5免疫器官指數(shù)的測(cè)定：將小鼠稱(chēng)重，脫頸椎處死后測(cè)定免疫器官指數(shù)[6]。

1.2刺五加提取物抗疲勞實(shí)驗(yàn)

1.2.1實(shí)驗(yàn)材料：UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海玉田分析儀器公司)；HH-S26S型電熱恒溫水浴鍋 (北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；電子天平(上海麥尚科學(xué)儀器有限公司)；血乳酸試劑盒(上海弘順生物科技研究所)；昆明種小鼠(南京君科生物工程有限公司)；刺五加提取物(西安品誠(chéng)生物科技有限公司)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型建立：將40只小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：刺五加提取物低劑量組(1mg/g·d)、中劑量組(2mg/g·d)、高劑量組(4mg/g·d)和對(duì)照組，對(duì)照組灌胃0.02mL/g·d的生理鹽水，連續(xù)給藥30d。根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]的方法，采用小平臺(tái)水環(huán)境法，自制鼠箱復(fù)制SD動(dòng)物模型。利用此裝置可以制造大鼠睡眠剝奪模型。

1.2.3體重測(cè)定與力竭游泳時(shí)間的測(cè)定：用電子天平測(cè)定實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及結(jié)束時(shí)小鼠體重的變化。進(jìn)行小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)[7]，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4血乳酸測(cè)定:根據(jù)文獻(xiàn)[7]，對(duì)血乳酸進(jìn)行定量測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1刺五加提取物體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.1.1一般情況的觀察： 正常對(duì)照組小鼠行為敏捷，皮毛光滑，大便黃褐色，無(wú)腥臭，成形；睡眠剝奪組小鼠開(kāi)始出現(xiàn)精神不振、扎堆、瞇眼、消瘦、反應(yīng)緩慢等現(xiàn)象，毛色黯淡無(wú)光、小鼠大便稀溏、有腥臭；與正常組相比，刺五加提取物4mg/g·d、2mg/g·d劑量組小鼠活動(dòng)頻率如常，攝食尚可，為深褐色軟便，基本無(wú)變化。而刺五加提取物1mg/g·d劑量組及維生素E(VE)對(duì)照組小鼠毛色較暗，反應(yīng)略遲緩，少數(shù)小鼠大便稀。除正常對(duì)照組和刺五加提取物2mg/g·d劑量組外，其余四組均有小鼠死亡，其中睡眠剝奪組死亡2只，4mg/g·d、1mg/g·d劑量組及VE對(duì)照組各死亡1只。

2.1.2免疫器官指數(shù)：與正常組比較，睡眠剝奪組、1mg/g·d劑量組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著降低(*P<0.05)，而2mg/g·d、4mg/g·d劑量組與正常組比較脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)無(wú)顯著差異(*P>0.05)。四個(gè)治療組與睡眠剝奪組比較脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著升高(▲P<0.05)。因此，刺五加提取物三個(gè)治療組均可升高小鼠免疫器官指數(shù)，且升高幅度隨劑量的增減而增減。VE對(duì)照組也可有效升高小鼠免疫器官指數(shù)，而刺五加提取物高劑量組要高于VE對(duì)照組。

表1　免疫器官指數(shù)的測(cè)定

組別動(dòng)物數(shù)脾臟指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g)正常對(duì)照組104.86±0.251.16±0.18睡眠剝奪組83.09±0.31*0.82±0.11*VE對(duì)照組94.12±0.29*▲0.91±0.18*▲低劑量組93.99±0.36*▲0.87±0.15*中劑量組94.35±0.27*▲1.02±0.19*▲高劑量組104.66±0.33*▲1.14±0.13*▲

2.1.3血清超氧化物歧化酶(SOD)活性:與正常組比較，睡眠剝奪組、VE對(duì)照組、1mg/g·d劑量組血清SOD活性顯著降低(*P<0.05)，而2mg/g·d、4mg/g·d劑量組與正常組比較無(wú)顯著差異(*P>0.05)。1mg/g·d、2mg/g·d、4mg/g·d劑量組與睡眠剝奪組比較有明顯升高(▲▲P<0.01)；VE對(duì)照組與睡眠剝奪組比較有明顯升高(▲P<0.05)。刺五加提取物能增強(qiáng)血清SOD的活性，且升高幅度隨劑量的增減而增減。VE對(duì)照組也能有效增強(qiáng)血清SOD的活性，但刺五加提取物2mg/g·d、4mg/g·d劑量組要優(yōu)于VE對(duì)照組。

表2　血清超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)±s)

2.1.4血清丙二醛(MDA)含量：睡眠剝奪組、VE對(duì)照組、1mg/g·d劑量組丙二醛(MDA)的含量較正常組比顯著升高(*P<0.01)，2mg/g·d劑量組含量升高*(P<0.05)，而4mg/g·d劑量組與正常組比較血清MDA的含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。1mg/g·d、2mg/g·d、4mg/g·d劑量組與睡眠剝奪組比較血清MDA的含量均顯著降低(▲P<0.01)；VE對(duì)照組與1mg/g·d劑量組MDA的含量無(wú)顯著差異(P>0.05)；4mg/g·d、2mg/g·d劑量組MDA的含量顯著低于VE對(duì)照組(P<0.01)；4mg/g·d劑量組MDA含量顯著低于低劑量組(▲▲P<0.01)?？梢?jiàn)刺五加提取物能顯著降低血清MDA含量，且降低幅度隨劑量的增減而增減。VE對(duì)照組也能有效降低血清MDA含量，但刺五加提取物4mg/g·d、2mg/g·d劑量組要優(yōu)于VE對(duì)照組。

表3　血清丙二醛(MDA)含量檢測(cè)

組別動(dòng)物數(shù)MDA(nmol/mL)正常對(duì)照組106.92±0.79睡眠剝奪組813.71±0.96*VE對(duì)照組99.88±0.64*低劑量組99.25±0.74*▲中劑量組108.53±0.59*▲高劑量組97.48±0.81▲▲

2.2刺五加提取物抗疲勞實(shí)驗(yàn)

2.2.1體重測(cè)定：各組小鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始及結(jié)束時(shí)的體重與對(duì)照組比較差異不明顯(*P>0.05)，這說(shuō)明刺五加提取物不能顯著增長(zhǎng)小鼠的體重。

表4　刺五加提取物對(duì)小鼠體重的影響±s,n=8)

2.2.2力竭游泳時(shí)間測(cè)定：2mg/g·d、4mg/g·d劑量組小鼠力竭游泳時(shí)間均顯著高于對(duì)照組小鼠(*P<0.05)。1mg/g·d劑量組小鼠的力竭游泳時(shí)間的個(gè)體間的差異比較大，統(tǒng)計(jì)結(jié)果無(wú)明顯差異。即刺五加提取物對(duì)延長(zhǎng)小鼠力竭游泳的時(shí)間起到顯著改善作用，其中以2mg/g·d劑量組作用最明顯。

表5　力竭游泳時(shí)間測(cè)定

組別力竭游泳時(shí)間(s)對(duì)照組912±367低劑量組1481±513中劑量組2921±603*高劑量組3296±474*

2.2.3血乳酸測(cè)定:小鼠游泳30min后，分別眼眶采血檢測(cè)血乳酸。2mg/g·d劑量組小鼠血乳酸水平顯著低于對(duì)照組(**P<0.01)，1mg/g·d劑量組、4mg/g·d劑量組小鼠的血乳酸水平低于對(duì)照組(*P<0.05)。說(shuō)明刺五加提取物能夠降低運(yùn)動(dòng)后小鼠血乳酸的水平，其中以2mg/g·d劑量組效果最明顯。

表6　血乳酸測(cè)定

組別運(yùn)動(dòng)前血乳酸運(yùn)動(dòng)后血乳酸對(duì)照組4.75±0.6313.28±1.28低劑量組4.52±0.598.95±1.42*中劑量組4.71±0.498.32±1.65**高劑量組4.45±0.718.67±1.79*

3　討論

刺五加(Acanthopanax senticocus)為五加科多年生木本植物，其提取物主要有效成分為異秦皮定、綠原酸、芝麻素，硬脂酸，β-谷甾醇、多糖等。刺五加具有抗疲勞、抗癌、抗衰老、抗輻射、抗菌消炎的作用；此外，它還可以改善心血管功能，改善大腦血供，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，調(diào)節(jié)血壓，止咳祛痰，增強(qiáng)免疫力，改善大腦皮質(zhì)的興奮、抑制過(guò)程，提高腦力勞動(dòng)效能[8]。抗氧化能力是機(jī)體生存必不可少的重要條件，一般睡眠剝奪可能導(dǎo)致肌肉酸痛，肌肉萎縮，混亂，記憶的失誤或損失，幻覺(jué)，抑郁，眶周浮腫，血壓升高，激素水平升高，肌纖維痛，眼球震顫[9~11](不自主節(jié)律性眼球運(yùn)動(dòng))，肥胖，困倦，精神疾病類(lèi)癥狀，乃至注意缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)也有所報(bào)道。

經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，睡眠剝奪組小鼠反應(yīng)遲鈍、精神萎靡、體重下降、毛色黯淡無(wú)光，這是由于睡眠剝奪能夠加速機(jī)體的新陳代謝使機(jī)體營(yíng)養(yǎng)失調(diào)，對(duì)外來(lái)入侵的病原體抵抗下降，使小鼠體內(nèi)的抗氧化能力降低，引起小鼠血清中的SOD和MDA的含量發(fā)生變化。經(jīng)過(guò)高、中和低三種劑量的刺五加提取物治療后，小鼠血清中的SOD升高，MDA含量降低(均P<0.05)，而且其療效均與劑量呈正相關(guān)，并且小鼠的一般情況明顯改善，其表現(xiàn)較對(duì)照組基本相同如反應(yīng)靈敏、毛色光澤，攝食量正常等。在給小鼠灌入刺五加提取物后進(jìn)行力竭游泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示2mg/g·d、4mg/g·d劑量組小鼠力竭游泳時(shí)間顯著高于對(duì)照組小鼠(P<0.05)。1mg/g·d、2mg/g·d、4mg/g·d劑量組小鼠的血乳酸水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，表明刺五加提取物能夠顯著降低運(yùn)動(dòng)后小鼠血清乳酸的濃度。以上研究均表明刺五加提取物能夠顯著提升睡眠剝奪小鼠體內(nèi)抗氧化及抗疲勞的能力。

刺五加的活性成分大都具有酚羥基，可抗氧化，抗疲勞，使注意力集中，減少工作失誤。本實(shí)驗(yàn)表明，大鼠在睡眠剝奪后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體抗氧化能力降低，刺五加提取物能夠明顯改善上述癥狀并且對(duì)抗疲勞。

參考文獻(xiàn):

[1]賈秀月，高艷華.自由基與抗衰老的研究概況[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2007,29(2)：37-39

[2]Locke SE, Kraus L, Leserman J, et al. Life chang stress, psychiatric symptoms and natural kill cell activity[J].Psychosom Med,1984,46(8):441-446

[3]徐輝,魏曉東,歐芹,等.1D-半乳糖衰老模型大鼠肝臟形態(tài)學(xué)及抗氧化能力變化的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2005,28(10):26-27

[4]姜波濤.探討一種新的大鼠取血方法舌下靜脈采血[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(5):384

[5]Machado RB , Hipolide DC , Benedito Silva AA , et al. Sleep deprivation induced by the modified multiple plat form t ech nique:quantification of sleep loss and recovery[J] .Brain Res,2004,1004(1-2): 45-51

[6]李儀奎主編.中國(guó)藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)出版社,1991,155-167

[7]江海濤,任源浩,吳雨龍,等.蛹蟲(chóng)草多糖對(duì)小鼠抗疲勞作用的研究[J].食用菌學(xué)報(bào),2014,21(3):55-59

[8]趙蕾,魏曉東,葛堂棟,等.黃芪血清對(duì)衰老細(xì)胞抗氧化作用及p16表達(dá)影響的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2006,29(10):4-5

[9]孟玲欣,范貴民,王景濤.改良多平臺(tái)水環(huán)境法制作大鼠REM睡眠剝奪模型的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2013,36(2):99

[10]劉娟,郝春艷,李鳳偉.柳蘭鞣質(zhì)含量動(dòng)態(tài)分析及體外抗氧化作用研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,37(3):19-21

[11]Citek K,Ball B,Rutledge,et al.Nystagmus testing in intoxicated individuals[J].Optometry St Louis Mo,2003,74(11):695-698

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0001-03

基金項(xiàng)目：①黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：C2012-42。

作者簡(jiǎn)介：張淑萍(1969~)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

通訊作者：黃作義(1963~)男，黑龍江雞西人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: blcldxn@163.com。

(收稿日期：2015-06-05)