慢病毒轉染海馬神經(jīng)元的模型建立

于金鵬,　伍國鋒,　王麗琨

?

慢病毒轉染海馬神經(jīng)元的模型建立

于金鵬,伍國鋒,王麗琨

目的建立一種簡單易行的體外慢病毒轉染海馬神經(jīng)元的實驗方法。方法取懷孕的SD大鼠，分離體內胎鼠的海馬后，經(jīng)Accutase消化后接種，采用無血清培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，選擇合適的時間將慢病毒加入神經(jīng)元內，于不同的時間在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞內GFP的顯影效果。結果慢病毒轉染海馬神經(jīng)元后，在第3天時觀察，細胞內GFP在倒置熒光顯微鏡下顯影達到80%以上。結論此方法簡單易行，慢病毒轉染神經(jīng)元的成功率高，為慢病毒轉染海馬神經(jīng)元后的后續(xù)實驗奠定了實驗基礎。

海馬；神經(jīng)元；慢病毒；轉染

海馬神經(jīng)元已經(jīng)廣泛地應用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究，包括神經(jīng)元的發(fā)育分化、神經(jīng)元再生、神經(jīng)疾病的發(fā)生機制等方面。尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如AD、癲癇、腦血管疾病研究中更加突顯其作用的重要性，在疾病的發(fā)生機制中，為了研究相關基因對蛋白的調控作用，往往借助攜帶目的基因的慢病毒轉染海馬神經(jīng)元后，進行深入的研究。但是神經(jīng)元的培養(yǎng)對于實驗技術要求高，同時，由于神經(jīng)元的生長代謝緩慢，體外存活時間短，對外界的環(huán)境變化敏感，故慢病毒轉染海馬神經(jīng)元的難度增加。本實驗建立了一種簡單易行，慢病毒轉染神經(jīng)元的成功率高模型的實驗方法，為慢病毒轉染海馬神經(jīng)元后的后續(xù)實驗奠定了實驗基礎。

1　材料與方法

1.1慢病毒和主要試劑孕19 d的SPF級SD大鼠(E19)(貴陽醫(yī)學院實驗動物中心提供)。Neurobasal?-A Medium (1X)、GlutaMAXTMSupplemen、B-27?Serum-Free Supplement (50X)、雙抗(青霉素/鏈霉素)、胎牛血清均購自Gibco。DMEM/F12購自Hyclone。多聚賴氨酸、Accutase酶購自Sigma。Lentiviral vectors(上海吉凱基因)，Enhanced Infection Solution (上海吉凱基因)。

1.2海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)紫外燈照消毒超凈臺及操作間，并將手術器械高壓滅菌后備用。取出SD孕鼠，經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，解刨腹部，取出胎鼠，75%酒精清洗。用眼科剪刀斷其頭部剪開皮膚及顱骨，暴露雙側大腦半球，取出攜帶部分腦干的大腦組織，放入預冷的Hanks液培養(yǎng)皿中。用眼科無齒尖鑷小心分開皮質，暴露并取出雙側海馬組織，盡量去除殘留的血管和腦膜，放入15 ml離心管中置于冰上。以上解剖應在1 h內完成。 用Hanks液清洗海馬組織，加入5倍于海馬組織體積的Accutase酶于37 ℃培養(yǎng)箱中消化10 min。當海馬組織塊體積明顯減少時，終止液終止消化，加入種植液至3 ml。先用塑料巴斯德滴管吹打數(shù)次，至組織變小，再用火焰拋光的巴斯德滴管吹打3遍，用200目細胞篩過濾至另一個離心管內，得到細胞原液。經(jīng)臺盼藍染色細胞計數(shù)，以5×105/ml細胞密度接種于24孔板中，置于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 h后全量換液為飼養(yǎng)液培養(yǎng)，以后每周2～3次半量換液，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.3海馬神經(jīng)元的鑒定一般在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7～14天時狀態(tài)最佳，因此本實驗選擇在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天時進行純度鑒定，采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶 (NSE)抗體免疫組化染色技術。免疫組化染色結果的判斷標準及方法：以胞質或突起染成棕黃色為陽性神經(jīng)元。在高倍顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)其陽性細胞的個數(shù)，重復5次，取其均值作為陽性神經(jīng)元的百分率。

1.4慢病毒轉染海馬神經(jīng)元按照上海吉凱公司的慢病毒手冊，按照不同的感染復數(shù)(MOI),分別在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第1天、第7天時，進行慢病毒轉染，24 h后更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，72 h后在通過倒置熒光顯微鏡觀察細胞內GFP的表達，并用MTB2011 Configuration 2.2.0.6分析病毒轉染效率。MOI分別選取5、10、15、20。

2　結　果

2.1神經(jīng)元純度的測定用 NSE對海馬神經(jīng)元進行鑒定， 所得陽性反應細胞的純度為(86.32±1.48)%。

2.2慢病毒轉染時間及轉染效率的鑒定在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第1天、第7天時，分別進行慢病毒轉染，并設計不同的MOI，72 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP細胞內顯影效果，觀察海馬神經(jīng)元的轉染效率。結果顯示，在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第1天，及MOI=10時，慢病毒的轉染效率達到最佳狀態(tài)，可到達80%以上，可用于后續(xù)的實驗。

3　討　論

3.1原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)一直以來神經(jīng)元在原代培養(yǎng)中都是棘手的問題，選擇胎鼠作為取材，提取細胞的活性好，易于后續(xù)的慢病毒轉染神經(jīng)元。筆者總結了如下經(jīng)驗:(1)實驗從取材到接種完畢的時間一定控制在2 h內完成;(2)在海馬神經(jīng)元貼壁4 h后，立即進行全量無血清培養(yǎng)基換液，不僅盡早清除雜質，也降低神經(jīng)元的分化[1～3];(3)在消化海馬組織時，鑒于胰蛋白酶對細胞的毒性大，且消化時間和濃度不宜控制，故采用Accutase酶;(4)在抑制膠質細胞過度增殖方面，用無血清培養(yǎng)，添加了B27補充劑，促進神經(jīng)元的成長，抑制了膠質細胞的生長。此實驗方法可獲得高純度、高活力的海馬神經(jīng)元，操作簡單，無需特殊設備。

3.2慢病毒轉染海馬神經(jīng)元在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生機制研究中，往往借助于慢病毒攜帶目的基因來研究靶點蛋白的調控變化，但是多數(shù)考慮慢病毒轉染神經(jīng)元的效率低，采用細胞系代替，但本文提供慢病毒轉染海馬神經(jīng)元的方法，也是簡單易行，轉染效率高，總結經(jīng)驗如下：(1)選擇胎鼠海馬神經(jīng)元進行慢病毒轉染；(2)轉染時間的選擇，在海馬神經(jīng)元培養(yǎng)第1天時為適宜;(3)轉染時，不宜加轉染增強劑，由于轉染增強劑對神經(jīng)元有毒性，不僅會引起細胞死亡，也會導致細胞變異。同時，采用Enhanced Infection Solution 作為緩沖稀釋病毒液，進行無血清培養(yǎng)，雙抗對于慢病毒的轉染效率無關；轉染24 h后換液，更換為無病毒的維持培養(yǎng)基飼養(yǎng)[4～8]。4 h、72 h后，在熒光顯微下觀察神經(jīng)元內的GFP顯影效率，在MOI=10時，可達到80%以上，通常熒光會持續(xù)2～3 d，在第6天時，GFP熒光開始消失。

本文的慢病毒轉染海馬神經(jīng)元的方法簡單，且效率高，為后續(xù)借助其研究海馬神經(jīng)元相關基因的調控機制，提供很好實驗模型，同時也為進一步研究海馬神經(jīng)元的相關疾病提供了實驗基礎。

[1]Yi-Shuian Huang,Joel D.Richter.Analysis of mRNA translation in cultured hippocampal neurons[J].Methods in Enzymology，2007，431：143-162.

[2]Alessandra L,Scotti M,Gudrun Herrmann.Reelin immunoreactivity in dissociated cultures of the postnatal hippocampus[J].Brain Research,2002,924:209-218.

[3]Andreas Grabrucker，Bianca Vaida，Jargen Bockmann，et al．Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture[J].Cell Tissue Res，2009，338:333-341.

[4]Naseer Ml,Lee HY,Ullah N,et al.siRNA-mediated GABA(B) receptor at early fetal rat brain upon acute and chronic ethanol exposure:down regulation of PKA and p-CREB expression Synapse[J].Neuroscience Synapse,2011,65(2):109-118.

[5]Fang M,Feng C,Zhao YX,et al．Camk2b protects neurons from homocysteine-induced apoptosis with the involvement of HIF-1αsignal pathway[J].Int J Clin Exp Med,2014,7(7):1659-1668.

[6]Scott B,Sun CL,Mao X,et al.Role of Oxygen consumption in hypoxiaprotection by translation factor depletion[J].J Exp Biol,2013，216(12):2283-2292.

[7]Chen X,Nelson CD,Li X,et al.PSD 95 is required to sustain the molecular organization of the postsynaptic density[J].J Neurosci,2011,31(17)：6329-6338.

[8]Edelman DB,Owens GC,Chen S.Neuromodulation and mitochondrial transport:live imaging in hippocampal neurons over long durations[J].J Vis Exp,2011,17(52):2599.

Establishing model of lentivirus transfection of hippo-campal neurons

YUJinpeng,WUGuofeng,WANGLikun.

(EmergencyDepartmentofNeurology,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

ObjectiveTo establish a simple and practical method of slow virus in vitro transfection method of hippocampal neurons.MethodsThe hippocampus were isolated from neonatal rat(1 d),and digested with accutase.Hippocampal neurons were planted and cultuted with serum-free neurobassal.The Lentivirus were added into the neurons at the appropriate time,then observe the enhancement effect of GFP in the cell at different timesIn the inverted fluorescence microscope.ResultsHippocampal neuron cultures are infected after 3 days in vitro by simply adding the amount of virus,and estimated to infect up to 80% of all neurons based on checking for fluorescent protein expression In the inverted fluorescence microscope.ConclusionsThe persent protocol is a simple and efficient method for lentiviral transfection of hippocampal neurons.

Hippocampus;Neurons;Lentiviral vectors;Transfection

1003-2754(2016)02-0161-02

2015-10-09；

2015-11-30

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急診神經(jīng)內科,貴州 貴陽 550004)

伍國鋒，E-mail:wuguofeng3013@sina.com

R741

A