白 晗任獻(xiàn)青
1.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南鄭州 450000
基于代謝組學(xué)的中醫(yī)證型物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)展
白 晗1任獻(xiàn)青2▲
1.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南鄭州 450000
中醫(yī)證型是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)辨證論治的產(chǎn)物,關(guān)于中醫(yī)證型的標(biāo)準(zhǔn)化研究是中醫(yī)現(xiàn)代化的標(biāo)志,相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究是其重要組成部分。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后逐漸興起的學(xué)科。以“航拍角度”探測(cè)生物體在不同生理病理?xiàng)l件下的下游代謝物質(zhì),可準(zhǔn)確反映出生物體實(shí)時(shí)代謝狀態(tài),與中醫(yī)的整體性、動(dòng)態(tài)性、即時(shí)性更為貼近?;诖x組學(xué)的中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)化研究擁有廣闊的發(fā)展前景。
代謝組學(xué);中醫(yī)證型;物質(zhì)基礎(chǔ);代謝標(biāo)志物
中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)化研究是中醫(yī)現(xiàn)代化的必由之路,包括證型分類標(biāo)準(zhǔn)化和物質(zhì)基礎(chǔ)研究?jī)纱蟛糠?。繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后,代謝組學(xué)的興起為中醫(yī)證型物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的契機(jī),本文就基于代謝組學(xué)的中醫(yī)證型物質(zhì)基礎(chǔ)研究進(jìn)行闡述。
中醫(yī)“證”是對(duì)疾病過(guò)程中所處一定階段的病位、病因、病性以及病勢(shì)等所作的病理性概括,是機(jī)體對(duì)體內(nèi)外各種環(huán)境變化和致病因素作出反應(yīng)的一種整體功能狀態(tài),并隨著病程的發(fā)展而發(fā)生相應(yīng)變化[1]。近年來(lái),研究學(xué)者多運(yùn)用流行病學(xué)、循證醫(yī)學(xué)、數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)化研究,取得了豐富成果。中醫(yī)證型物質(zhì)基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究方興未艾,對(duì)于專業(yè)技術(shù)手段要求較高。基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)都曾被用于此,但研究方法多以某一種或幾種分子或蛋白質(zhì)為研究對(duì)象,所得結(jié)果較為局限、單一,無(wú)法突出中醫(yī)證型的整體性、動(dòng)態(tài)性等特點(diǎn)。
代謝組學(xué)時(shí)代,發(fā)現(xiàn)微觀物質(zhì)的聯(lián)系相當(dāng)廣泛,某一物質(zhì)的改變會(huì)導(dǎo)致全盤(pán)的變動(dòng),這符合現(xiàn)代系統(tǒng)論原理,即任何一種生命現(xiàn)象都是整體層面的復(fù)雜生理活動(dòng)的有機(jī)整合[2]。代謝組學(xué)技術(shù)以機(jī)體某一中醫(yī)證型狀態(tài)為橫斷面,全面檢測(cè)該狀態(tài)下機(jī)體代謝下游的小分子化合物,可為中醫(yī)證型提供明確的物質(zhì)基礎(chǔ)。
2.1 概況
1971年,Devaux等[3]提出代謝輪廓分析技術(shù),但并未廣泛使用;1983年,Nicholson等[4]最早把1H NMR技術(shù)用于檢驗(yàn)血漿、血清中的小分子代謝物;1999年,Nicholson等[5]概括代謝組學(xué)定義為,以動(dòng)物的體液或組織為研究對(duì)象,研究生物體對(duì)生理病理刺激或基因修飾產(chǎn)生的代謝物質(zhì)的質(zhì)和量的動(dòng)態(tài)變化;2000年,F(xiàn)iehn等[6]正式提出“代謝組學(xué)(metabolomics)”這個(gè)名詞。
代謝組學(xué)是對(duì)代謝路徑最終代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析研究,因其能準(zhǔn)確地反映出機(jī)體整體的代謝水平狀況,故可更直觀、更客觀地反映出生命活動(dòng)的本質(zhì)的過(guò)程[7]。因此代謝組學(xué)技術(shù)也更符合以整體觀念和辨證論治為特色的中醫(yī)學(xué)的要求,是中醫(yī)學(xué)融入現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)的重要途徑。
2.2 研究方法
代謝組學(xué)主要技術(shù)手段是核磁共振(NMR),液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS),氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS),色譜(HPLC,GC)等。通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用這些技術(shù)手段,研究者能夠?qū)ι矬w代謝過(guò)程中的各種化合物進(jìn)行全面和定量分析[8]。通過(guò)檢測(cè)一系列樣品的譜圖,再結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法,可以判斷出生物體的病理生理狀態(tài),基因的功能,藥物的毒性和藥效等,并有可能找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物(biomarker)[9-10]。
2.3 生物樣本采集
因尿液、血清或血漿包含上百種待測(cè)物質(zhì),獲取途徑也較方便,已成為目前代謝組學(xué)研究中最常用的樣本[11],其他如腦脊液、膽汁、消化液、唾液、精液、羊水等,亦可作為代謝組學(xué)研究的樣本。血液樣本反映機(jī)體對(duì)病理或生理刺激的瞬時(shí)信息,評(píng)價(jià)機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡。尿液標(biāo)本常包含一段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的代謝信息,反映機(jī)體當(dāng)前的生理或病理狀態(tài)、生物學(xué)年齡,也可預(yù)測(cè)各種先天不足或外環(huán)境影響的致病率[12]。
2.4 測(cè)定方法
代謝組學(xué)技術(shù)包括核磁共振(NMR)、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC) 、高效液相色譜法(HPLC) 和質(zhì)譜法(MS)[13]等單分析技術(shù)及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)[14]等多分析技術(shù),其中以色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、NMR 技術(shù)最為常用。
2.5 數(shù)據(jù)分析
基于代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析方法有主成分分析法(PCA)、偏最小二乘法-判定分析(PLS-DA)、人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)(ANN)、聚類分析(NLM)等模式識(shí)別技術(shù)[15],其中以PCA和PLS-DA最為常用。PCA是常用的非監(jiān)督性模式識(shí)別方法,可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)降維的目的,利于了解數(shù)據(jù)整體情況;PLS-DA 是基于偏最小二乘法(PLS)線性回歸的統(tǒng)計(jì)分析方法,屬于有監(jiān)督模式識(shí)別方法,常適用于樣本量少、變量多、變量之間有相關(guān)性以及存在噪音變量干擾等情況。相對(duì)于 PCA 所得到的得分圖,PLS-DA 可以獲得更好的分類效果[16]。
3.1 心血瘀阻證
簡(jiǎn)維雄等[17]采用GC-MS對(duì)冠心?。–HD)心血瘀阻證和非心血瘀阻證患者的血漿進(jìn)行檢測(cè),并進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)花生四烯酸、乳酸、硬脂酸、尿素等9種代謝物為CHD心血瘀阻證患者的血漿代謝產(chǎn)物譜。其課題組之后進(jìn)行了對(duì)應(yīng)的動(dòng)物造模方法研究[18],采用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制急性心肌梗死( AMI) 心血瘀阻證模型,運(yùn)用 GC-MS 檢測(cè)方法,并對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行主成分分析、偏最小二乘法分析,發(fā)現(xiàn)大鼠 AMI 心血瘀阻證與心肌組織代謝產(chǎn)物蘋(píng)果酸、谷氨酸、甘氨酸、葡萄糖、延胡索酸等含量的改變密切相關(guān)。課題組[19]又使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)相關(guān)代謝物代謝通路進(jìn)行檢索和構(gòu)建,并對(duì)代謝產(chǎn)物分子注釋、相關(guān)的酶或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白行檢索,進(jìn)行代謝產(chǎn)物路徑分析,發(fā)現(xiàn)冠心病心血瘀阻證患者中“半乳糖代謝”“酮體的合成和降解通路”發(fā)生變化參與其病理過(guò)程。
3.2 熱傷腎絡(luò)證
耿雨作[20]選擇符合條件的紫癜性腎炎熱傷腎絡(luò)證、非熱傷腎絡(luò)證患兒各9例,健康患兒22例,運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù),以尿液為研究對(duì)象,初步得出兒童紫癜性腎炎熱傷腎絡(luò)證的特異性代謝產(chǎn)物可能是丙酸、醛固酮、均聚L-精氨酸、維生素K2、鈍葉素葡萄糖苷、S-氨甲基二氫硫、苯丙精氨酸、L-蛋氨酸、同型半胱氨酸硫內(nèi)酯、羥基絡(luò)醇4-硫酸醋、精氨酰絲氨酸、雌酮、色氨酰蛋氨酸。
3.3 肺氣虛證
劉志剛等[21]將56只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,模型組建造肺氣虛型COPD大鼠模型,并與對(duì)照組相比較,采用HPLC-MS/MS檢測(cè)方法檢測(cè)血漿代謝物,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)精胺、雙氫神經(jīng)酰胺、十二烷二酰肉堿等10種代謝物為COPD肺氣虛證可能的疾病標(biāo)記物。
3.4 氣虛血瘀證
朱明丹等[22]選擇當(dāng)?shù)蒯t(yī)院符合心肌梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證納入標(biāo)準(zhǔn)的患者為研究對(duì)象,年齡40~70歲, 共30例,空腹采集靜脈血標(biāo)本,離心后取上清液,進(jìn)行代謝組學(xué)特征譜的研究,發(fā)現(xiàn)心肌梗死恢復(fù)期氣虛血瘀證較健康對(duì)照組溶血磷脂酰膽堿,亞油酸、花生四烯酸、鞘氨醇類物質(zhì)的代謝水平均下調(diào)。
3.5 脾氣虛證與脾陽(yáng)虛證
王穎等[23]以多因素復(fù)合的方法建立脾氣虛、脾陽(yáng)虛大鼠模型,以1H NMR技術(shù)對(duì)大鼠進(jìn)行血漿代謝組學(xué)檢測(cè),分別采用弛豫編輯(CPMG)和擴(kuò)散編輯(LED)脈沖序列對(duì)代謝物進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)脾氣虛證的可能代謝物有:葡萄糖、乳酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脂類等12種;脾陽(yáng)虛證可能代謝物有:葡萄糖、乳酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺等13種,該二證型主要存在能量代謝、脂代謝和糖代謝等異常。
3.6 先天伏寒證
魏巖等[16]發(fā)現(xiàn)利用代謝組學(xué)方法能夠確定冠心病心絞痛患者先天伏寒證與非先天伏寒證間存在著明顯的差異性代謝產(chǎn)物,高密度脂蛋白、丙氨酸、乳酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、谷氨酰胺、α-葡萄糖、β-葡萄糖、N-乙酰糖蛋白、脂類化合物有可能成為冠心病先天伏寒證的潛在生物標(biāo)記物。
3.7 痰濁證與血瘀證
張紅栓等[24]選擇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的冠心病心絞痛痰濁痹阻證(痰濁證), 心血瘀阻證(血瘀證)患者各10例,對(duì)其血漿樣本進(jìn)行H NMR檢測(cè),用主成分分析與偏最小二乘判別分析處理圖譜數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)痰濁證組乳酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白等12種代謝物含量高于血瘀證組;反之,血瘀證組丙氨酸、高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸等7種代謝物含量高于痰濁證組。
3.8 痰濁證與氣虛證
程鵬等[25]選取冠心病患者65例(痰凝心脈證37 例,心氣虛弱證28 例),應(yīng)用GC /MS技術(shù)測(cè)定兩種證型患者的血清內(nèi)源性代謝物,并分析其代謝譜之間的差異,最終得到準(zhǔn)確定性的化合物 46 個(gè),對(duì)鑒別這兩種證型貢獻(xiàn)值最大的化合物為絲氨酸,其次為纈氨酸、2-羥基丙酸等。對(duì)兩種證型代謝物量進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)痰濁證絲氨酸、2-羥基丙酸顯著高于氣虛證組(P<0.05)。
3.9 脾氣虛證與脾胃濕熱證
施旭光等[26]選擇慢性淺表性胃炎脾氣虛證、脾胃濕熱證患者各10例,健康志愿者10例 ,對(duì)其尿液進(jìn)行H-NMR檢測(cè),并采用多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析,在脾氣虛證患者和健康志愿者尿液中共篩選得到谷氨酸、甲硫氨酸、α-酮戊二酸、二甲基甘氨酸、肌酐、牛磺酸及葡萄糖7種差異代謝產(chǎn)物;在脾胃濕熱證患者和健康志愿者尿液中篩選得到2-羥基丁酸、氧化三甲胺、?;撬帷ⅠR尿酸4種差異代謝產(chǎn)物;在脾氣虛證和脾胃濕熱證患者中篩選得到巖藻糖、β-羥基丁酸等11種差異代謝產(chǎn)物。
(1)代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于中醫(yī)證型研究尚未成熟,關(guān)于代謝組學(xué)的試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)、液相、氣相及質(zhì)譜條件標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)分析等,仍有待確立相應(yīng)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[27];(2)國(guó)內(nèi)目前基于代謝組學(xué)的中醫(yī)證型研究多以動(dòng)物造模為研究對(duì)象,缺乏臨床病例的大樣本量研究。由于中醫(yī)證候的多樣性、復(fù)雜性和易變性,動(dòng)物模型無(wú)法完全模擬人體代謝狀態(tài),也不可忽略動(dòng)物模型與人體存在的差別[28]。(3)中醫(yī)證型分類以臨床表現(xiàn)為基礎(chǔ),可見(jiàn)主證和標(biāo)證,不同癥候間相互兼夾,對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)分析會(huì)有一定影響,這也導(dǎo)致了研究結(jié)果的重復(fù)性較低[29]; 但相較于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù),代謝組學(xué)有其不可忽略的優(yōu)勢(shì),其整體性、動(dòng)態(tài)性的研究方法,與中醫(yī)證型有異曲同工之妙,已成為現(xiàn)今中醫(yī)證型物質(zhì)基礎(chǔ)研究不可替代的技術(shù)手段。
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Research progress on material basis of TCM Syndrome based on metabonomics
BAI Han1REN Xianqing2
1.Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China; 2.The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China
TCM Syndrome Types is the product of traditional Chinese medicine syndrome differentiation and treatment. Research on standardization of TCM syndrome type is the symbol of modernization of traditional Chinese Medicine. The research of related material basis is an important part. Metabonomics is a subject that has been developed gradually after genomics, proteomics and proteomics. investigation of the downstream metabolites of organisms under different physiological and pathological conditions under “Aerial view” accurately reflect the metabolism of organisms in real time. It is more closer to the integrity, dynamics, immediacy of Chinese medicine. Study on standardization of TCM Syndrome Types based on metabonomics has broad prospects for development.
Metabonomics; TCM Syndrome; Material basis; Metabolic marker
R223
A
2095-0616(2016)21-52-04
2016-09-08)
▲通訊作者