重癥監(jiān)護(hù)病房耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性分析

潘慧瓊, 袁雪峰, 周　敏, 厲曉玲, 李露池

(長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院, 湖南 長(zhǎng)沙　410005)

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重癥監(jiān)護(hù)病房耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性分析

潘慧瓊, 袁雪峰, 周敏, 厲曉玲, 李露池

(長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院, 湖南 長(zhǎng)沙410005)

[摘要]目的了解重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的藥敏結(jié)果及同源性。方法對(duì)2014年4—5月某院ICU患者和環(huán)境分離的11株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以及采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)擴(kuò)增法進(jìn)行同源性分析。結(jié)果11株肺炎克雷伯菌8株分離自患者，3株分離自環(huán)境，標(biāo)本分布以痰為主(6株，占54.55%)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：10株(90.91%)對(duì)環(huán)丙沙星耐藥；11株對(duì)復(fù)方磺胺甲口惡唑均敏感，對(duì)亞胺培南均為中介，對(duì)其余抗菌藥物耐藥率均為100%。11株肺炎克雷伯菌均有3個(gè)條帶，可以分為2型：Ⅰ型10株(1～5號(hào)、7～11號(hào)菌株)，Ⅱ型1株(6號(hào)菌株)。結(jié)論醫(yī)院ICU肺炎克雷伯菌耐藥嚴(yán)重，ICU患者和環(huán)境分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌為同一克隆株。加強(qiáng)ICU環(huán)境清潔、消毒及監(jiān)測(cè)，有利于減少和及時(shí)預(yù)警多重耐藥菌，降低醫(yī)院感染。

[關(guān)鍵詞]肺炎克雷伯菌; 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌; 同源性; 重癥監(jiān)護(hù)病房; 醫(yī)院感染

[Chin Infect Control，2015，14(12)：827-829]

醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)是救治危重患者的場(chǎng)所，患者常進(jìn)行各種侵入性操作，接受大量抗菌藥物治療，伴有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，免疫功能低下，常導(dǎo)致醫(yī)院感染的發(fā)生，成為多重耐藥菌產(chǎn)生和傳播的高發(fā)區(qū)域。肺炎克雷伯菌是最常見的醫(yī)院感染病原菌，可引起下呼吸道、泌尿生殖道、血液、傷口及顱內(nèi)等部位感染。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌逐漸增多[1]，已成為全球性問題，ICU多重耐藥菌管理面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本研究對(duì)某一時(shí)間段內(nèi)某院ICU患者和環(huán)境分離的11株肺炎克雷伯菌進(jìn)行藥敏檢測(cè)和同源性分析，探討多重耐藥菌感染患者病房環(huán)境消毒和環(huán)境監(jiān)測(cè)的必要性。

1材料與方法

1.1菌株來(lái)源收集2014年4—5月某院ICU患者和環(huán)境分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。

1.2儀器與試劑主要包括Vitek-32型全自動(dòng)微生物分析儀及配套鑒定卡(法國(guó)生物梅里埃公司)、Real-Time PCR(美國(guó)Applied Biosystems)、DYY-ll型電泳儀(北京君意東方設(shè)備有限公司)、數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)、瓊脂糖(GENE COMPANY LED)。

1.3菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)細(xì)菌鑒定采用法國(guó)生物梅里埃公司ATB細(xì)菌鑒定儀和相應(yīng)的鑒定卡?？咕幬锩舾性囼?yàn)為微量肉湯法，按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2012年版標(biāo)準(zhǔn)操作及判斷結(jié)果，抗菌藥物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、替卡西林/克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢拉啶、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢西丁、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲口惡唑。

1.4同源性分析DNA的提?。喝?20℃保存的肺炎克雷伯菌菌種接種于血平板，轉(zhuǎn)種3次，挑取單個(gè)菌落接種于肉湯培養(yǎng)基。取3 mL培養(yǎng)液，離心后采用緩沖液和蛋白酶K處理，吸附柱進(jìn)行過濾，用洗脫液對(duì)吸附柱進(jìn)行洗脫，12 000 r/min離心3 min，提取DNA置-20℃保存?；蛲葱苑治觯翰捎秒S機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)擴(kuò)增DNA模板,引物序列為(5’-3’):5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3[2]，引物均由上海生工生物工程有限公司合成?？偡磻?yīng)體系25 μL：7.5 μL滅菌雙蒸水，12.5 μL 2×Master MIX，2 μL引物ERIC 2，模板3 μL。RAPD反應(yīng)條件[2]：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5 min。將RAPD產(chǎn)物置于2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳；每孔加DNA產(chǎn)物7 μL。電泳條件為電壓70 V，電流60 mA，時(shí)間120 min。

1.5DNA同源性判定標(biāo)準(zhǔn)DNA條帶位置完全相同者，為同一型；相差一條者，密切相關(guān)，為亞型；不滿足上述條件者為不同基因型[2]。

2結(jié)果

2.1一般資料2014年4—5月該院ICU共檢出耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌11株，其中8株來(lái)源于ICU患者送檢標(biāo)本， 3株來(lái)源于ICU環(huán)境采樣。標(biāo)本分布為痰(6株)，清潔后呼吸機(jī)出口(2株)，血、分泌物、呼吸機(jī)面板各1株。

2.2藥敏結(jié)果11株肺炎克雷伯菌對(duì)哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、替卡西林/克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢拉啶、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢西丁、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星均100%耐藥；對(duì)復(fù)方磺胺甲口惡唑均敏感,對(duì)亞胺培南均為中介。10株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥，耐藥率90.91%。

2.3細(xì)菌同源性鑒定電泳結(jié)果顯示，11株肺炎克雷伯菌均有3個(gè)條帶，可以分為2型：Ⅰ型10株(1～5號(hào)、7～11號(hào)菌株)，Ⅱ型1株(6號(hào)菌株)。見圖1。

M: marker;1—11泳道：11株碳青霉烯類肺炎克雷伯菌標(biāo)本;N:陰性對(duì)照

圖1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌RAPD電泳圖

Figure 1RAPD electrophoresis map of CRKP

3討論

肺炎克雷伯菌作為一種條件致病菌所導(dǎo)致的感染在細(xì)菌感染學(xué)疾病中的所占比重日漸增加，Amazian等[3]對(duì)地中海地區(qū)27所醫(yī)院調(diào)查顯示，肺炎克雷伯菌占醫(yī)院感染的9.20%；我國(guó)肺炎克雷伯菌是醫(yī)院感染的主要致病菌之一，占9.03%[4]。隨著β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類和碳青霉烯類等抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥菌迅速出現(xiàn)，多重耐藥菌的分離率逐年上升。同一克隆株在醫(yī)院內(nèi)的播散容易導(dǎo)致多重耐藥菌的暴發(fā)流行，國(guó)外曾報(bào)道一起因多重耐藥肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染暴發(fā)流行，感染患者病死率高達(dá)40%[5]。

預(yù)防與控制多重耐藥菌的傳播和流行是迫切需要解決的問題。菌株基因同源性分析對(duì)醫(yī)院感染暴發(fā)流行的來(lái)源，以及傳播途徑的追蹤具有重要意義。常用的同源性分析方法有質(zhì)粒指紋圖譜分析、限制性核酸內(nèi)切酶分析、RAPD、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、重復(fù)序列分析[6-7]。RAPD具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，有助于查找醫(yī)院感染源，切斷感染途徑，是一種值得推廣的方法。

本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，11株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥譜基本相同，對(duì)大部分抗菌藥物均耐藥，說(shuō)明醫(yī)院ICU肺炎克雷伯菌耐藥嚴(yán)重，藥敏結(jié)果相同表明菌株可能來(lái)自同一個(gè)克隆株?；蛲葱苑治鲲@示，除6號(hào)痰標(biāo)本分離株外，其余7株臨床分離株與3株環(huán)境標(biāo)本分離株基因型相同，證實(shí)10株菌均來(lái)自同一克隆菌株。藥敏和基因分析結(jié)果表明，肺炎克雷伯菌能從患者擴(kuò)散到周圍環(huán)境，并且在環(huán)境中存活，潛在可能通過環(huán)境途徑進(jìn)行傳播，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌在ICU內(nèi)傳播。因此，有必要加強(qiáng)對(duì)環(huán)境的清潔與消毒，減少環(huán)境中多重耐藥菌；定期對(duì)環(huán)境衛(wèi)生進(jìn)行采樣分析，對(duì)環(huán)境消毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià)；對(duì)多重耐藥菌的暴發(fā)進(jìn)行預(yù)警，有效降低多重耐藥菌在ICU內(nèi)的傳播。研究[8]報(bào)道，加強(qiáng)環(huán)境監(jiān)測(cè)，使其衛(wèi)生清潔質(zhì)量保持在較高水平，可有效防控ICU多重耐藥菌醫(yī)院感染，降低醫(yī)院感染發(fā)病率。

多重耐藥菌感染增加患者疾病的治療難度，影響搶救成功率和預(yù)后。環(huán)境因素作為外源性危險(xiǎn)因素應(yīng)重點(diǎn)控制，通過對(duì)環(huán)境進(jìn)行及時(shí)的清潔與消毒，有效避免了因交叉感染造成的耐藥菌株傳播，對(duì)遏止醫(yī)院感染的蔓延能發(fā)揮重要作用。通過采取有效的消毒隔離措施，可最大程度減少醫(yī)院感染的發(fā)生。常規(guī)環(huán)境衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)是對(duì)消毒效果的監(jiān)測(cè)，針對(duì)性檢測(cè)是有重點(diǎn)的過程監(jiān)控，有利于找出工作中的薄弱環(huán)節(jié)或存在的隱患，是防止醫(yī)院感染暴發(fā)流行有效的監(jiān)測(cè)方式。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1]肖素香.外科重癥監(jiān)護(hù)病房醫(yī)院感染原因分析及預(yù)防對(duì)策[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2008, 18(2):178-180.

[2]Bou G, Cerveró G, Domínguez MA,et al. Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistantAcinetobacterbaumanniistrain with a carbapenem-hydrolyzing enzyme; high-level carbapenem resistance inA.baumanniiis not due solely to the presence of beta-lactamases[J].J Clin Microbiol, 2000, 38: 3299-3305.

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[4]文細(xì)毛, 任南, 吳安華, 等.全國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)控網(wǎng)醫(yī)院感染病原菌分布及變化趨勢(shì)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2011, 21(2):350-355.

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[7]李丹, 吳安華, 馮麗, 等.重癥監(jiān)護(hù)室患者與環(huán)境分離的多重耐藥不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌同源性研究[J].中國(guó)感染控制雜志, 2008, 7(5):306-309.

[8]陳惠清, 林晨曦, 周春蓮.環(huán)境衛(wèi)生質(zhì)量對(duì)預(yù)防ICU多重耐藥菌醫(yī)院感染作用的研究[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志, 2014, 31(5):493-497.

(本文編輯：陳玉華)

·論著·

Homology of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaein an intensive care unit

PANHui-qiong，YUANXue-feng，ZHOUMin，LIXiao-ling，LILu-chi(TheFirstHospitalofChangsha,Changsha410005,China)

[Abstract]ObjectiveTo understand antimicrobial resistance and homology of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) from an intensive care unit (ICU).Methods11 CRKP isolates from patients and environment of an ICU in a hospital were performed antimicrobial susceptibility testing, the homology of CRKP was analyzed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method.ResultsOf 11 CRKP isolates, 8 were from patients, and 3 from environment, the main specimen was sputum(n=6, 54.55%). Antimicrobial susceptibility testing results revealed that 10 (90.91%) CRKP isolates were resistant to ciprofloxacin; 11 isolates were susceptible to compound sulfamethoxazole, intermediate to imipenem, and resistant to other antimicrobial agents(100%). All 11 CRKP isolates had 3 bands, and were divided into two types: (type Ⅰ, n=10; type Ⅱ, n=1).ConclusionAntimicrobial resistance of Klebsiella pneumoniae in ICU is serious, CRKP isolated from ICU patients and environment are of the same clone. Cleaning, disinfection, and monitoring of ICU environment should be strengthened, which is helpful for reducing, timely warning of multidrug-resistant organisms, and reducing healthcare-associated infection.

[Key words]Klebsiella pneumoniae; carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae; homology; intensive care unit; healthcare-associated infection

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2015.12.011

[通信作者]王莉E-mail: toto-86@163.com

[作者簡(jiǎn)介]王莉(1977-)，女(漢族)，江蘇省東臺(tái)市人，副主任醫(yī)師，主要從事醫(yī)院感染研究。

[基金項(xiàng)目]湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)“消毒領(lǐng)域科研創(chuàng)新”(XKC2015-06)

[收稿日期]2015-05-22

[中圖分類號(hào)]R181.3+2R378

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-9638(2015)12-0827-03