HMGB1抗體對(duì)刀豆蛋白A引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用

黃澤炳，黃　燕，周蓉蓉，陳若蟬，易盼盼，李　寧，范學(xué)工

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙　410008)

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HMGB1抗體對(duì)刀豆蛋白A引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用

黃澤炳，黃燕，周蓉蓉，陳若蟬，易盼盼，李寧，范學(xué)工

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410008)

[摘要]目的研究高遷移率族蛋白1(HMGB1)抗體對(duì)刀豆蛋白A(ConA)引起小鼠肝損傷的保護(hù)作用。方法將健康無(wú)污染雄性Balb/c小鼠分成空白對(duì)照組(注射生理鹽水)、模型組(注射ConA)和實(shí)驗(yàn)組(注射ConA+HMGB1抗體)，3組小鼠注射藥物6 h后摘眼球取血,所獲血液離心后取血清檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和HMGB1，留取肝臟組織進(jìn)行HE染色、Tunel、免疫熒光等檢測(cè)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織病理炎癥反應(yīng)輕于模型組。小鼠血清中ALT、HMGB1：空白對(duì)照組分別為(52.00±8.34)U/L、(7.54±0.53)ng/mL，模型組分別為(5 551.50±1 445.74)U/L、(18.06±1.65)ng/mL，實(shí)驗(yàn)組分別為(1 977.40±654.89)U/L、(10.77±0.71)ng/mL；肝組織中HMGB1 mRNA、HMGB1表達(dá)量(相對(duì)值)：空白對(duì)照組分別為1.886±0.253、0.086±0.028，模型組分別為4.718±0.341、0.268±0.043，實(shí)驗(yàn)組分別為3.005±0.331、0.116±0.008；實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中ALT、HMGB1，以及肝組織中HMGB1 mRNA、HMGB1表達(dá)量均低于模型組(均P<0.001)。肝組織細(xì)胞凋亡、肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1遷移(標(biāo)準(zhǔn)化)：空白對(duì)照組均為1±0，模型組分別為4.67±0.33、4.50±0.22，實(shí)驗(yàn)組分別為2.67±0.21、2.33±0.21；實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織細(xì)胞凋亡、肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1遷移均低于模型組(均P<0.001)。結(jié)論HMGB1抗體能改善肝組織的病理?yè)p傷，可以保護(hù)ConA引起的小鼠肝損傷。

[關(guān)鍵詞]HMGB1抗體； 高遷移率族蛋白1； 刀豆蛋白A； 肝損傷； 保護(hù)作用； 肝損傷模型； 急性肝損傷； 模型小鼠

[Chin Infect Control，2015，14(12)：793-797]

肝損傷是一種臨床常見(jiàn)情況，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，并發(fā)癥多，甚至病情危急，不及時(shí)處理會(huì)發(fā)展為肝衰竭而死亡。乙型肝炎病毒(HBV)感染是我國(guó)急性肝損傷最常見(jiàn)的病因，一般認(rèn)為肝損傷是由HBV感染引起的宿主免疫反應(yīng)所導(dǎo)致[1]。在HBV感染導(dǎo)致的肝損傷過(guò)程中，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)在肝損傷過(guò)程中起關(guān)鍵作用[2]，其他非特異性免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等也發(fā)揮了重要作用[3]。此外，由活化的免疫細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α等也參與了肝細(xì)胞損傷作用[4-5]。目前仍缺乏有效的治療肝損傷的醫(yī)療手段。高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)是一類(lèi)在真核細(xì)胞中含量豐富的非組蛋白核蛋白[6]。近年研究[7]表明,細(xì)胞核內(nèi)HMGB1轉(zhuǎn)移至胞外后，演變成一種炎癥介質(zhì)。HMGB1既可以作為炎癥細(xì)胞因子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，又能與多種促炎介質(zhì)相互誘導(dǎo)表達(dá)，還能引起炎癥信號(hào)分子NF-kB核移位，形成一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，啟動(dòng)、維持和放大炎癥反應(yīng)[8-9]。因此，HMGB1在致炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中可能是一個(gè)關(guān)鍵中心環(huán)節(jié)[10]。紐約大學(xué)Wang等[11-12]認(rèn)為，HMGB1抗體可以用來(lái)治療敗血癥。本課題在前期工作的基礎(chǔ)上使用刀豆蛋白A(ConA)建立小鼠肝損傷模型，觀察HMGB1抗體對(duì)小鼠肝損傷的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物雄性Balb/c小鼠(SPE級(jí))，6周齡，體重約20 g，由中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到中南大學(xué)動(dòng)物學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用認(rèn)證協(xié)會(huì)(IA CU C) 批準(zhǔn)。

1.2試劑ConA、Elisa試劑盒等購(gòu)自于Sigma公司。HMGB1抗體由美國(guó)紐約大學(xué)王海潮(Haichao Wang)提供[11-12]。

1.3動(dòng)物模型將健康無(wú)污染雄性Balb/c小鼠分成3組：空白對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組。模型組、實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射ConA 20 mg/kg(ConA溶于無(wú)熱源的生理鹽水，濃度為2 mg/mL)，空白對(duì)照組的小鼠尾靜脈注射生理鹽水(200 μL/20 g。1 h后，空白對(duì)照組、模型組小鼠腹腔注射生理鹽水200 μL /20 g，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射anti-HMGB1 100 μg/20 g(anti-HMGB1溶于生理鹽水，濃度為0.5 mg/mL)。6 h后摘小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死后取肝臟。血液離心后獲的血清及所取肝組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1HE染色采用HE染色檢測(cè)小鼠肝組織病理變化。石蠟切片5 μm脫蠟后蘇木素染色3 min，自來(lái)水沖洗后0.5%鹽酸乙醇分化30 s，自來(lái)水沖洗后伊紅染色1 min，切片水洗后快速通過(guò)梯度乙醇脫水，晾干后封片備用。

1.4.2Tunel使用Tunel方法觀察肝組織的細(xì)胞凋亡。石蠟切片在二甲苯中脫蠟2次，每次5～10 min。乙醇水合(100%、95%、90%、80%、75%)每組2 min；PBS漂洗2次，滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K，20～37℃作用 20 min，PBS洗滌3次。室溫在封閉液(3%雙氧水溶于甲醇)中封閉10 min，PBS漂洗3次，根據(jù)試劑盒制備Tunel反應(yīng)混合液，每個(gè)樣本加反應(yīng)液50 μL，加蓋玻片37℃恒溫避光濕潤(rùn)反應(yīng)60 min，熒光顯微鏡下檢測(cè)觀察(其中陰性對(duì)照組中反應(yīng)液不加TdT酶)。

1.4.3免疫熒光采用免疫熒光法檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1的遷移。取石蠟切片，二甲苯中脫蠟2次，每次5～10 min。乙醇水合(100%、95%、90%、80%、75%)每組2 min；PBS沖洗3次，1%的Triton破膜20 min，羊血清封閉30 min，加第一抗體(1∶200)后孵育12 h，陰性對(duì)照用熒光二抗代替第一抗體；第二抗體室溫(避光)孵育2 h，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，照相，圖像軟件分析平均灰度值。

1.4.4血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和HMGB1檢測(cè)使用速率法檢測(cè)ALT,ELISA檢測(cè)血清中HMGB1。

1.4.5Western blot應(yīng)用Western blot檢測(cè)肝組織HMGB1表達(dá)量。提取組織總蛋白，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，加1∶500一抗(HMGB1)4℃孵育過(guò)夜，1∶2 000二抗室溫孵育2 h，TBST洗凈3次后加ECL發(fā)光液，觀察結(jié)果。

1.4.6實(shí)時(shí)定量熒光PCR(real time PCR)檢測(cè)按照說(shuō)明書(shū)步驟，采用TRIZOL(Invitrogen公司)法提取RNA，取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA:HMGB1上下游引物分別為5’- CTGCCTACAGAGCTAAAGGA-3’，5’- CTGCGCTAGAACCAACTTAT-3’；β-actin引物分別為5’- GGCATCCATGAAACTACATT-3’、5’- GATCTTCATGGTGCTAGGAG-3’。 反應(yīng)體系:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL,上下游引物各2 μL, 2×SYBR Green PCR Master mix 12.5 μL,ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s， 95℃ 15 s， 60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)結(jié)束。

2結(jié)果

2.1小鼠肝組織病理變化HE染色結(jié)果顯示:空白對(duì)照組小鼠病理切片未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠見(jiàn)肝細(xì)胞變性、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)明顯的肝細(xì)胞壞死，但匯管區(qū)見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

圖1 　小鼠肝組織病理變化(HE染色，n=6)

2.2小鼠肝組織細(xì)胞凋亡情況標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞凋亡程度：空白對(duì)照組為1±0，模型組為4.67±0.33，實(shí)驗(yàn)組為2.67±0.21，各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=65,P<0.001)；各組兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組肝組織細(xì)胞凋亡程度輕于模型組。

2.3肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1遷移情況胞核轉(zhuǎn)移至胞漿的HMGB1(標(biāo)準(zhǔn)化遷移程度)：空白對(duì)照組為1±0，模型組為4.50±0.22，實(shí)驗(yàn)組為2.33±0.21。各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=99.12,P<0.001);兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),實(shí)驗(yàn)組HMGB1遷移量較模型組少。見(jiàn)圖2。

圖2 　肝細(xì)胞中HMGB1遷移情況(n=6)

2.4小鼠血清中ALT和HMGB1表達(dá)量空白對(duì)照組小鼠血清中ALT為(52.00±8.34)U/L，模型組為(5 551.50±1 445.74)U/L，實(shí)驗(yàn)組為(1 977.40±654.89)U/L。各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.27,P=0.002)；兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中ALT低于模型組。見(jiàn)圖3。小鼠血清中HMGB1:空白對(duì)照組為(7.54±0.53)ng/mL，模型組為(18.06±1.65)ng/mL，實(shí)驗(yàn)組為(10.77±0.71)ng/mL，各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.76,P<0.001);兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中HMGB1低于模型組。

圖3 　血清ALT的變化(n=6)

2.5小鼠肝組織HMGB1 mRNA和HMGB1表達(dá)量肝組織HMGB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量：空白對(duì)照組為1.886±0.253，模型組為4.718±0.341，實(shí)驗(yàn)組為3.005±0.331；各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.03,P<0.001)；兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織HMGB1 mRNA低于模型組。見(jiàn)圖4。小鼠肝組織中HMGB1表達(dá)量(單位：相對(duì)灰度值)：空白對(duì)照組為0.086±0.028，模型組為0.268±0.043，實(shí)驗(yàn)組為0.116±0.080，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.45,P=0.001)；兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織中HMGB1表達(dá)量低于模型組。見(jiàn)圖5。

圖4 　小鼠肝組織HMGB1 mRNA表達(dá)(n=6)

Figure 4Expression of HMGB1 mRNA in mice liver tissue (n=6)

圖5 　肝組織中HMGB1的表達(dá)(n=6)

Figure 5Expression of HMGB1 in mice liver tissue (n=6)

3討論

我國(guó)病毒性肝炎尤其是乙型肝炎所致的肝損傷患者數(shù)量居全球首位，由于缺乏有效的特異性治療手段, 肝損傷常發(fā)展為病死率極高的肝衰竭。肝損傷或肝衰竭的主要機(jī)制是宿主炎癥反應(yīng)，由于肝炎病毒感染宿主的特異性，當(dāng)前缺乏理想的乙肝病毒所引起的肝損傷動(dòng)物模型。學(xué)界認(rèn)為，ConA誘導(dǎo)小鼠肝損傷的免疫發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為與乙型肝炎病毒所致肝損傷相類(lèi)似，是可替代后者的理想動(dòng)物模型[2,13-14]。通過(guò)尾靜脈注射ConA至鼠體內(nèi)后，可刺激T細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IFN-γ、TNF-α[13]。研究[4-5]認(rèn)為，IFN-γ能激活包括NK細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞定植或聚集在肝臟，引起炎癥和損害，而TNF-α具有肝細(xì)胞毒性作用。

HMGB1是一種炎癥因子，能夠介導(dǎo)其他炎癥因子引起炎癥瀑布。研究證實(shí)，HMGB1在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用[7]；HMGB1在炎癥發(fā)生后的數(shù)小時(shí)開(kāi)始大量分泌[15]，因此我們認(rèn)為較早中和HMGB1可能很大程度上減弱炎癥反應(yīng)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HMGB1抗體處理后的小鼠肝組織中HMGB1相對(duì)含量、mRNA相對(duì)量，以及血清中HMGB1含量、ALT值均低于模型組(ConA處理)。HMGB1抗體處理后小鼠肝組織HE染色見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但未見(jiàn)壞死，肝細(xì)胞凋亡輕微。而未加HMGB1抗體處理的小鼠肝組織HE染色顯示，肝組織大片壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且細(xì)胞凋亡明顯。說(shuō)明特異性HMGB1抗體能夠通過(guò)中和降低肝組織中及體內(nèi)HMGB1，保護(hù)肝臟避免受到損傷。實(shí)驗(yàn)組小鼠注射ConA 1 h后即注射HMGB1抗體，目的是為較早中和炎癥狀態(tài)下釋放出的HMGB1，盡可能減少HMGB1引起的炎癥損傷，以及炎癥瀑布，結(jié)果顯示，注射HMGB1抗體6 h后能有效阻止肝損傷。

肝損傷危害較大，盡早控制肝損傷對(duì)于患者的預(yù)后有很大幫助。本實(shí)驗(yàn)在其他研究者的研究基礎(chǔ)之上，證實(shí)使用HMGB1抗體早期干預(yù)可以有效減輕肝臟的損害程度，說(shuō)明HMGB1能成為有效防治肝損傷的重要靶點(diǎn)，為進(jìn)一步研究防治肝損傷提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯：左雙燕)

·論著·

Protective role of high mobility group box-1 protein antibody in ConA-induced liver injury in mice

HUANGZe-bing,HUANGYan,ZHOURong-rong,CHENRuo-chan,YIPan-pan,LINing,FANXue-gong(XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China)

[Abstract]ObjectiveTo detect the protective role of high mobility group box-1 protein (HMGB1) antibody in concanavalin A(ConA)-induced liver injury in mice.MethodsThe healthy male Balb/c mice were grouped into control group (saline injection), model group(ConA injection) and experimental group(ConA+HMGB1 antibody injection). After 6 hours of injection, mice blood was collected for detecting alanine transaminase (ALT) and HMGB1,liver tissue was used to do HE stain, Tunel, and immunofluorescence detection.ResultsPathological inflammation in experimental group was slighter than model group. The levels of ALT and HMGB1 in mice serum were (52.00±8.34)U/L and (7.54±0.53)ng/mL in control group，(5 551.50±1 445.74)U/L and (18.06±1.65)ng/mL in model group，(1 977.40±654.89)U/L and (10.77±0.71)ng/mL in experimental group, respectively; the expression levels of HMGB1 mRNA and HMGB1 (relative value) in liver tissue were 1.886±0.253 and 0.086±0.028 in control group，4.718±0.341 and 0.268±0.043 in model group，3.005±0.331 and 0.116±0.008 in experimental group, respectively; the expression levels of ALT and HMGB1 in serum, as well as HMGB1 mRNA and HMGB1 in liver tissue of experimental group were all lower than model group(all P<0.001). Apoptosis and HMGB1 migration in the liver cell (normalized) were 1±0 and 1±0 in control group, 4.67±0.33 and 4.50±0.22 in model group，2.67±0.21 and 2.33±0.21 in experimental group, respectively; apoptosis and HMGB1 migration in liver tissue of experimental group were both lower than model group(both P<0.001).ConclusionHMGB1 antibody can improve the pathological injury of liver tissue, and protect mice liver against the injury induced by ConA.

[Key words]HMGB1 antibody; high mobility group box-1; concanavalin A; liver injury; protective role; liver injury model; acute liver injury; mouse model

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2015.12.002

[通信作者]王強(qiáng)E-mail：ttyywq@163.com

[作者簡(jiǎn)介]康建磊(1988-)，男(漢族)，河南省鄭州市人，住院醫(yī)師，主要從事神經(jīng)外科顱內(nèi)感染診治研究。

[收稿日期]2015-02-28

[中圖分類(lèi)號(hào)]R575

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-9638(2015)12-0793-05