丹參二萜醌對PC9肺癌移植瘤動物炎癥微環(huán)境的作用研究*

張夢陽 張光霽 樓招歡

浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 311400

丹參二萜醌(DT)是從中藥丹參（唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge根）中經(jīng)超臨界萃取、高速逆流色譜純化而得富含隱丹參酮和丹參酮ⅡA的有效部位[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)DT具有良好的抗肺癌作用，可通過內(nèi)質網(wǎng)應激介導的凋亡途徑促進肺癌細胞凋亡[2]，但其抗肺癌作用機制尚需進一步深入研究。研究發(fā)現(xiàn)很多癌癥發(fā)生在感染、慢性刺激和炎癥部位，雖然炎癥與腫瘤發(fā)生之間的機制尚不十分明確，但炎癥微環(huán)境對于腫瘤發(fā)生發(fā)展至關重要[3]。本文擬通過觀察丹參二萜醌對肺癌荷瘤裸鼠血清炎癥因子水平等的作用，從腫瘤炎癥微環(huán)境角度，闡述丹參二萜醌抗肺癌作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：分述如下。

1.1.1 細胞株及動物：人肺腺癌PC9細胞由浙江省中醫(yī)院中心實驗室提供；健康裸鼠，5周齡，雄性，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號碼SCXK（滬）2008-0016；小鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心SPF級小鼠飼養(yǎng)室，溫度22±1℃，濕度50%～70%。于實驗前適應性喂養(yǎng)1周，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥品與試劑：取丹參二萜醌適量，加入適量吐溫研磨后加純水稀釋成混懸液。TNF-α、IL-6、IL-1β的ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器：SERIESII WATER JACKET CO2細胞培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；SW-II ALB3型超凈工作臺，上海上凈凈化設備有限公司；VARIOSKAN FLASH多功能全波長酶標儀，美國Thermo公司；al204電子天平，上海托利多儀器有限公司；MoorFLPI散斑全幀實時掃描成像系統(tǒng)，英國Moor公司。

1.2 實驗方法：分述如下。

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及接種：取液氮凍存的人肺腺癌PC9細胞，將凍存管置于37℃的水浴鍋中迅速晃動使細胞溶解，將細胞及培養(yǎng)液吸入備好的離心管（內(nèi)含5ml備好的10%FBS的DMEM培養(yǎng)液）中，800rpm/min，離心5min，棄上清，加入1ml 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞使其均勻，將人肺腺癌PC9細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，放置于飽和濕度、5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中。觀察人肺腺癌PC9細胞的生長狀態(tài)，待細胞生長至80%～90%時，加1ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，待其鏡下細胞形狀變圓，用2ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心速率800rpm，離心5min，棄上清，取1ml含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞使其均勻，置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，隔天傳代。收集PC9細胞，加1ml 10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞使其均勻，取10μl細胞懸液，貼著載玻片邊緣注入細胞計數(shù)板，鏡下計數(shù)，調整細胞個數(shù)為2×107/ml的單細胞懸液后，以0.1ml/只的量注射接種于裸鼠腋部皮下，行體內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 動物分組及給藥：接種人肺腺癌PC9細胞后，將裸鼠稱重、編號，隨機分為模型對照組（模型組）、DT低、中、高劑量組（15、30、60mg/kg）和順鉑對照組（順鉑組）（1mg/kg），每組7只。造模7天后開始灌胃給藥，連續(xù)4周。

1.2.3 一般體征觀察：對實驗小鼠每3天測1次體重，分組記錄。觀察并記錄各組小鼠的精神、活動、毛發(fā)、飲食、大小便、皮膚（包括肛周）等一般情況，對實驗期間死亡的小鼠進行解剖，大體觀察并留取組織學標本。

1.2.4 樣本制備：實驗期末，各組小鼠禁食不禁水12h，稱定體質量，游標卡尺測量瘤徑；眼后靜脈叢采血，4℃，3500r/min離心15min，分離血清，供炎癥因子檢測用；解剖小鼠，完整剝離瘤塊，稱重，計算抑瘤率。

1.2.5 血清炎癥因子水平檢測：取上述采集的血清樣本，ELISA法檢測各樣本中TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子水平，操作嚴格按照說明書進行。

1.2.6 腫瘤組織c-JUN、COX-2蛋白表達檢測：采用免疫組化法。取上述經(jīng)10%福爾馬林固定的瘤組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（4μm），免疫組化DAB顯色法（脫蠟→水化→抗原修復→滅活內(nèi)源性過氧化氫酶→5%BSA封閉→孵育抗c-JUN、COX-2一抗或PBS→孵育二抗→DAB顯色→蘇木素染核→脫水→二甲苯透明→封片→鏡下觀察）觀察瘤組織中c-JUN、COX-2蛋白的表達，以細胞內(nèi)有明顯黃色/棕黃色顆粒判定為陽性細胞；采用image-pro plus5進行蛋白表達分析和統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件分析處理，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析多重比較，各數(shù)據(jù)均采用±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DT對荷瘤裸鼠體重及抑瘤率的影響：如表1結果顯示，各組裸鼠體重無顯著性差異（P＞0.05）；在抑瘤率上，順鉑和60mg/kg DT較為接近。

表1 各組體重及瘤重比較（±s，n=7）

表1 各組體重及瘤重比較（±s，n=7）

抑瘤率（%）-32.2-14.1-0.3 39.5分 組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組劑量 (mg/kg）-1 1 5 30 60體重（g）25.8±2.3 22.9±2.1 25.4±2.0 25.4±2.2 24.8±1.4

2.2 DT對荷瘤裸鼠血清炎癥因子及瘤組織c-JUN、COX-2表達的影響：由表2可見，30mg/kg DT能顯著降低荷瘤模型動物血清TNF-a、IL-6水平。60、30mg/kg DT能顯著抑制PC9肺癌移植瘤組織c-JUN和COX-2蛋白表達，改善腫瘤炎癥微環(huán)境（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

表2 各組血清炎癥因子水平比較（±s，n=7）

表2 各組血清炎癥因子水平比較（±s，n=7）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

分組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組IL-1β(pg/ml)14.4±1.2 14.0±1.8 17.0±2.2 13.4±1.0 13.7±2.7劑量（mg/kg）-1 1 5 30 60 TNF-α(pg/ml)87.7±18.9 34.7±2.1**75.1±15.0 52.7±14.6*82.9±28.0 IL-6(pg/ml)19.3±1.6 14.0±2.5**17.3±2.1 11.9±2.2**17.0±3.6

圖1 各組腫瘤組織c-JUN、COX-2蛋白表達（400×）

3 討論

已知炎癥為惡性腫瘤的第八大生物學特征，IL-6等炎癥細胞因子介導的炎癥反應在腫瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲過程中發(fā)揮了重要作用，靶向炎癥細胞因子的抗腫瘤藥物開發(fā)以及亞臨床和臨床研究已是目前腫瘤轉化醫(yī)學的一大熱點[4]。中醫(yī)學理論認為，腫瘤源于“正氣虧虛，毒瘀互結”脈絡而成，“癌毒”是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵因素；“癌毒”病機理論與腫瘤炎性微環(huán)境密切相關，癌毒的形成過程及病機特點與腫瘤炎性微環(huán)境中“炎癥-腫瘤”的轉化過程具有相似性?，F(xiàn)代研究表明，肺癌的發(fā)生發(fā)展與吸煙等刺激引起的肺局部持續(xù)炎癥狀態(tài)密切相關。香煙煙霧中含有的大量自由基可損傷肺泡上皮細胞，激活IKKβ/NF-κB、JNK通路，使IL-1β、IL-6等炎癥因子大量分泌，促進組織局部的炎癥反應，導致細胞過度增殖及細胞級聯(lián)反應活化，引起DNA不可逆損傷，啟動細胞向轉移性疾病發(fā)展，促進了肺癌的發(fā)生。

研究結果表明，丹參二萜醌能顯著降低荷瘤模型動物血清TNF-a、IL-6水平，抑制PC9肺癌移植瘤組織c-JUN和COX-2蛋白表達，抑制移植瘤生長。因此，丹參二萜醌能夠祛瘀去毒，抑制炎癥反應，改善腫瘤炎癥微環(huán)境，拮抗肺癌的發(fā)生。