血小板聚集功能檢測(cè)在冠心病治療中的應(yīng)用

郭　崢，安　健

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原 030001)；2.山西省心血管病醫(yī)院

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血小板聚集功能檢測(cè)在冠心病治療中的應(yīng)用

郭崢1，安健2

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原 030001)；2.山西省心血管病醫(yī)院

摘要：冠心病病人心血管事件的發(fā)病機(jī)制與血栓形成密切相關(guān)，而血小板聚集是導(dǎo)致血栓形成重要過(guò)程。如今，抗血小板治療在冠心病預(yù)防及治療方面起著重要作用，其核心機(jī)制是降低血栓事件的發(fā)生率。其中對(duì)抗血小板藥物進(jìn)行血小板聚集功能檢測(cè)，據(jù)檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)冠心病個(gè)體化治療有著重要臨床意義?，F(xiàn)對(duì)目前常見(jiàn)的幾種血小板功聚集能檢測(cè)方法及其臨床指導(dǎo)意義綜述如下。

關(guān)鍵詞：冠心病；血小板聚集功能；檢測(cè)；血栓；心血管事件

近年來(lái)，冠心病在我國(guó)呈逐年上升的趨勢(shì)，且發(fā)病年齡趨于年輕化，其中急性冠脈事件的發(fā)生嚴(yán)重威脅著人民的生命健康[1]。冠心病病人急性冠脈事件核心發(fā)病機(jī)制與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定及血栓形成密切相關(guān)，而血小板聚集是導(dǎo)致血栓形成重要過(guò)程。目前國(guó)內(nèi)外各項(xiàng)研究表明，由于血小板抵抗存在，即便給予充分抗血小板治療，仍出現(xiàn)心血管血栓事件[2]。

因此，據(jù)血小板聚集的檢測(cè)結(jié)果，指導(dǎo)個(gè)體化抗血小板治療才能明顯的減低病人心血管血栓事件的發(fā)生率。

血小板聚集是血小板主要功能之一，是指相鄰的血小板之間相互黏著成血小板團(tuán)塊的過(guò)程。其原理是致聚物把血小板激活后，使得糖蛋白Ⅱb/Ⅲa分子上的纖維蛋白原受體暴露，在Ca2+作用下GPⅡb/Ⅲa和纖維蛋白原及vWF結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致相鄰的血小板相互聚集，其中起橋梁作用的是GPⅡb/Ⅲa 分子[3]。血小板聚集功能在血小板血栓形成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前血小板聚集功能檢測(cè)是在體外模擬體內(nèi)狀況，在全血或富含血小板血漿中加入誘聚劑(ADP、花生四希酸、膠原等)刺激血小板上相應(yīng)的受體，誘導(dǎo)血小板聚集，并對(duì)其聚集功能水平進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。不同個(gè)體、不同狀態(tài)(如用抗血小板藥前后及對(duì)藥物的敏感程度不同)，血小板反映出不同的聚集功能狀態(tài)。因此該項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果不僅可以評(píng)價(jià)血小板的總體功能，同時(shí)也可以直接反應(yīng)使用抗血小板藥物病人的藥效情況。根據(jù)臨床需要，當(dāng)前檢測(cè)血小板聚集功能方法包括比濁法、流式細(xì)胞術(shù)、剪切誘導(dǎo)血小板聚集測(cè)定法、散射性粒子檢測(cè)法、全血電阻抗法、發(fā)色底物/發(fā)光物聚集法、快速血小板功能分析儀(VerifyNow)、血栓彈力圖等[4]。現(xiàn)對(duì)目前常見(jiàn)的幾種血小板功能檢測(cè)方法及其臨床指導(dǎo)意義做一概述。

1比濁法

1.1定義比濁法(light transmittance aggregometry，LTA)，是1960年由Bron首次提出的血小板功能檢測(cè)方法。其原理是通過(guò)設(shè)備將光濁度信號(hào)變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娪嵦?hào)的變化，然后通過(guò)記錄儀記錄描計(jì)曲線，計(jì)算得到最大的血小板聚集率[5]。不同誘聚劑通過(guò)產(chǎn)生各自獨(dú)特的血小板聚集曲線，評(píng)價(jià)不同抗血小板藥物的藥效情況。

1.2功能比濁法具有方便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，所以在臨床應(yīng)用比較普及，因此被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”[6]。同時(shí)比濁法也存在諸多缺陷，如樣本需求大；人工操作步驟多導(dǎo)致結(jié)果誤差大；重復(fù)性差；離心等操作導(dǎo)致樣本中血小板性質(zhì)和數(shù)量的變化；同時(shí)也導(dǎo)致血液中部分細(xì)胞的丟失，進(jìn)而不能準(zhǔn)確反映體內(nèi)血細(xì)胞之間的相互作用；影響因素多，如高脂血癥、高血糖等[7]；敏感性差，不能檢測(cè)較小的(5個(gè)血小板以下)血小板聚集物，因而此方法特別適用于血小板功能低下的檢測(cè)[8]。因?yàn)楸葷岱ù嬖谏鲜鲋T多不足，所以應(yīng)該積極尋找具有操作步驟簡(jiǎn)便、敏感性好的檢測(cè)血小板聚集功能的方法。

2流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)

2.1原理隨著檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，血小板聚集功能的檢測(cè)方法也隨之步入一個(gè)新的階段。其原理是在體外通過(guò)ADP活化全血或富血小板血漿(PRP) 血小板聚集，進(jìn)而應(yīng)用特異的熒光抗體 CD61 perCP 標(biāo)記已活化的血小板，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，在特定的波長(zhǎng)激發(fā)光照射下，經(jīng)過(guò)染色細(xì)胞發(fā)射出特殊熒光訊號(hào)，最后通過(guò)探測(cè)器收集，傳入計(jì)算機(jī)分析。其結(jié)果是應(yīng)用單個(gè)血小板數(shù)量的減小來(lái)評(píng)估血小板聚集功能[9]。

2.2全血法流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)點(diǎn)此方法與受檢者體內(nèi)環(huán)境較為相似；具有較高的重復(fù)性；FCM 敏感性高于濁度法，能分析單個(gè)或亞群血小板膜活化標(biāo)志物的測(cè)定；本法不使用同位素，沒(méi)有放射性污染；保證檢測(cè)的特異性[10]。同時(shí)此方法也存在諸多缺陷，如手工操作步驟多；檢測(cè)費(fèi)用高；此過(guò)程需在 45 min內(nèi)操作完成；不可床旁操作；由于血小板大小不等，可能存在因?yàn)榫奂w大小仍在設(shè)定的分界線之內(nèi)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可能偏低。雖然此方法存在著諸多不足，但在血小板聚集功能檢測(cè)方面也是新的進(jìn)展。

3剪切誘導(dǎo)血小板聚集測(cè)定法

3.1原理剪切誘導(dǎo)的血小板聚集(shear-induced platelet aggregation，SIPA)是指血液在流動(dòng)過(guò)程中因力學(xué)變化產(chǎn)生的剪切力導(dǎo)致血小板聚集，其在生理止血的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11]。其原理是：利用圓錐的不斷旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生剪切力，通過(guò)改變轉(zhuǎn)速的快慢控制剪切力的大小，進(jìn)而促進(jìn)血小板聚集，聚集的血小板引起PRP的透光度變化，最后通過(guò)特殊儀器繪制成聚集曲線[12]。

3.2應(yīng)用在動(dòng)脈性血栓(如心梗和腦血栓等)形成過(guò)程中把剪切力誘導(dǎo)產(chǎn)生的血小板聚集當(dāng)做一個(gè)重要的病理因素從而引起臨床的高度重視[13]。血小板的活化被認(rèn)為是腦血管動(dòng)脈血栓性疾病的病理過(guò)程中重要始動(dòng)因素。老年人的血管基本上都存在動(dòng)脈粥樣硬化或退行性變化，血管的局部狹窄處往往導(dǎo)致血流高切力；另外，血流在狹窄處或分叉處易產(chǎn)生湍流，同時(shí)動(dòng)脈內(nèi)的血流本來(lái)是潮汐式流動(dòng)，血小板承受的切變力并不恒定，并且經(jīng)常變動(dòng)，因此剪切誘導(dǎo)的血小板聚集最易在這些部位附近發(fā)生，是導(dǎo)致血栓形成主要原因之一。綜上所述探討剪切誘導(dǎo)的血小板聚集及針對(duì)其制定相應(yīng)的對(duì)策對(duì)血栓性疾病的防治具有重大意義，另外且較LTA法測(cè)定更為穩(wěn)定。但溫度和血小板數(shù)目對(duì)此法檢測(cè)結(jié)果都有較大的影響，此外技術(shù)操作較復(fù)雜、價(jià)格相對(duì)昂貴，在基層醫(yī)院推廣有困難。

4散射性粒子檢測(cè)法

散射性粒子檢測(cè)法是應(yīng)用血小板在聚集過(guò)程中散射光的變化來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，而其散射強(qiáng)度由血小板聚集塊大小及數(shù)量這2個(gè)指標(biāo)共同決定。通過(guò)聚光鏡把半導(dǎo)體激光( 波長(zhǎng) 675 nm)折射轉(zhuǎn)化成寬度約50 μm的帶狀光束，然后照射到裝有 PRP比色杯。此方法與比濁法相似：首先靜脈血被枸櫞酸鈉抗凝，通過(guò)離心分離得到PRP和PPP，接著將PPP透光率調(diào)到100%，然后把PRP注入比色杯，加入誘聚劑，最后通過(guò)經(jīng)聚光鏡折射后產(chǎn)生的帶狀光束照射，測(cè)定其聚集率。

此方法是通過(guò)聚集塊的大小及數(shù)量這2個(gè)指標(biāo)來(lái)測(cè)定散射光的強(qiáng)度和分布情況，評(píng)價(jià)血小板的凝聚功能。由于此方法不僅可以檢測(cè)出小凝聚塊，而且具有分別判斷大、小凝聚塊功能，因此在腎上腺素誘導(dǎo)聚集現(xiàn)象中應(yīng)用此方法，便可推斷腎上腺素導(dǎo)致血小板的聚集過(guò)程，首先是產(chǎn)生小凝聚塊，通過(guò)小凝聚塊融合成大凝聚塊。同時(shí)，仍存在自然凝聚檢出功能。自然凝聚的測(cè)定是指在不加任何誘聚劑的情況下測(cè)定體內(nèi)血小板是否存在輕度活化。自然凝聚現(xiàn)象在正常人體內(nèi)幾乎不存在，而2型糖尿病病人中存在此現(xiàn)象約占40%[14]。

5全血電阻抗法

電阻抗法(impedance platelet aggregometry，IPA)是1980年Cardina和Flower[15]利用電阻抗原理檢測(cè)全血血小板聚集功能的方法。其原理是測(cè)定經(jīng)過(guò)稀釋的抗凝全血的血小板聚集功能，應(yīng)用記錄儀準(zhǔn)確的記錄血液電極間電流或電阻的變化而形成的曲線，通過(guò)仔細(xì)觀察體外血小板聚集情況來(lái)評(píng)價(jià)血小板聚集功能。

全血阻抗法優(yōu)點(diǎn)：使用全血；樣本少，全血中有紅細(xì)胞、白細(xì)胞等同時(shí)存在，更能準(zhǔn)確反映血小板在體內(nèi)的功能狀態(tài)； 針對(duì)血液標(biāo)本，能夠克服因渾濁對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響[16]；操作簡(jiǎn)便快捷，同時(shí)也減少誤差，提高準(zhǔn)確率；可床旁操作。其最大不足之處：設(shè)備保存條件要求嚴(yán)格，每次測(cè)定后必須清洗電極，連接電極的電線小心放置；對(duì)小聚集物的形成不敏感，導(dǎo)致其難以滿足臨床工作的需要。

6快速血小板功能分析儀(VerifyNow)

VerifyNow血小板檢測(cè)系統(tǒng)(Accumetrics 公司，美國(guó))是對(duì)病人負(fù)荷劑量6 h和服用維持劑量 5 d后 1 h進(jìn)行血小板抑制水平測(cè)定。其原理應(yīng)用花生四烯酸、ADP及凝血酶受體激活肽分別對(duì)阿司匹林、P2Y 12 受體拮抗劑及GPI抗血小板藥物的血小板反應(yīng)情況進(jìn)行評(píng)估，其檢測(cè)原理與 LTA 法基本一致，并且可用全血作為樣本，另外檢測(cè)程序無(wú)手工操作，避免誤差，提高準(zhǔn)確率。VerifyNow系統(tǒng)可提供3個(gè)關(guān)于血小板活性的基本參數(shù)：①血小板殘余活行，反映在氯吡格雷或阿司匹林抑制作用下血小板剩余的活性程度；②血小板基線活性，以特定試劑作為激活劑，其反映了血小板最大的活性程度；③血小板抑制率，即血小板活性被有效抑制的程度。以上三者關(guān)系可表示為PRU/ARU=血小板基線活性×(1-抑制率)。以 P2Y 12 反應(yīng)單位(PRU)為檢測(cè)數(shù)值，依據(jù)PRU>240定義為氯吡格雷低反應(yīng)組，PRU≤240為正常反應(yīng)[17]。阿司匹林反應(yīng)單位 (ARU)表示，ARU >550 定義為阿司匹林低反應(yīng)性[18]。

優(yōu)點(diǎn)有操作簡(jiǎn)便、快速(約3 min)、應(yīng)用全血、需血量少、重復(fù)性強(qiáng)，可用于急診、床旁檢測(cè)， 而且與 LTA具有很好的一致性；缺點(diǎn)無(wú)調(diào)效方法，國(guó)內(nèi)檢測(cè)費(fèi)用較高，普及程度較低。

7血栓彈力圖 ( thrombelastography ，TEG)

TEG是由 Harter[19]于 1948年發(fā)明，之后很長(zhǎng)一段時(shí)間都應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室研究，直到20世紀(jì) 80年代才由美國(guó)匹茲堡的 Kang 首次在臨床肝臟移植手術(shù)中應(yīng)用此技術(shù)，主要是鑒別凝血系統(tǒng)的紊亂及指導(dǎo)術(shù)中輸血。如今 TEG 在各項(xiàng)手術(shù)中已廣泛應(yīng)用，如肝臟移植、心臟搭橋等。主要作用是監(jiān)測(cè)圍術(shù)期凝血功能，評(píng)估術(shù)中出血風(fēng)險(xiǎn)，指導(dǎo)術(shù)中輸血[20]。目前TEG在國(guó)際上已被大量用于冠心病抗血小板治療中，評(píng)價(jià)血小板的活性和抗血小板藥物的藥效情況等[21]，而國(guó)內(nèi)研究較少。由于TEG敏感性低、受肝素等因素影響，近年來(lái)對(duì)其進(jìn)行了一定的改良。改良后的 TEG 避免肝素影響，同時(shí)也增加其敏感性和重復(fù)性，使TEG得到更加廣泛的應(yīng)用。如今，血栓彈力圖(thrombelastogram，TEG)不僅是血小板聚集率的檢測(cè)工具，并且也能評(píng)估缺血事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。血栓彈力圖的工作原理：在凝血開始時(shí)，由于血塊在形成和溶解過(guò)程中受到牽拉作用被懸掛的金屬探針?biāo)袘?yīng)，進(jìn)而帶動(dòng)金屬探針的轉(zhuǎn)動(dòng)，使其在轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的一系列信號(hào)，最后由電腦程序處理上述信號(hào)得到血液凝固血小板圖。其血小板圖不僅可以反映阿司匹林低反應(yīng)也可以反映氯吡格雷低反應(yīng)，指導(dǎo)臨床治療。

TEG具有優(yōu)點(diǎn)：樣本為全血；血栓彈力圖靈敏度高，檢測(cè)過(guò)程15 min[22]，可評(píng)估病人出血風(fēng)險(xiǎn)[23]，重復(fù)性好，可床旁操作，設(shè)備保存條件方便，價(jià)格相對(duì)便宜。對(duì) TEG 的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步評(píng)估，主要影響因素有：標(biāo)本存放時(shí)間、測(cè)定方法、溫度、性別、糖尿病等。血栓彈力圖作為一種新型的血小板聚集功能的檢測(cè)方法，在具體方法和結(jié)果判定上，目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏統(tǒng)一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)， 還需更大規(guī)模、更加深入的研究來(lái)確立其標(biāo)準(zhǔn)。

8基因檢測(cè)

另外近期一些研究報(bào)道了 CYP2C19 酶功能缺失變體等位基因的載體以及細(xì)胞色素 P450 同種型參與了氯吡格雷的新陳代謝，成為它的活性代謝物，導(dǎo)致局部缺血事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加[24]。

基因檢測(cè)氯吡格雷是一種前體藥物，口服后經(jīng)腸道吸收，受ABCB1基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)體P-糖蛋白(P-gp)調(diào)控，約85%的氯吡格雷由醋酶轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的梭酸代謝物(SR26334)，只有不到15%的氯吡格林經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450 (CYP450)酶系統(tǒng)(主要包括CYP2C19、CYP3A4和CYP3A5等)代謝為活性代謝產(chǎn)物(一種硫醇衍生物)。肝臟CYP2C19基因編碼的酶蛋白是體內(nèi)氯吡格林活化代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，氯吡格雷在形成中間代謝產(chǎn)物2-氧-氯啦格雷及最終活性代謝產(chǎn)物的2步氧化過(guò)程中，分別有45%和20%是由CYP2C19基因編碼的CYP2C19蛋白介導(dǎo)[25]。目前國(guó)外相關(guān)研究證實(shí)：在急性冠狀動(dòng)脈綜合征或支架置入術(shù)后的冠心病病人中，CYP2C19功能缺失等位基因攜帶者與氯吡格雷低反應(yīng)性及不良臨床預(yù)后有顯著相關(guān)性[26]相關(guān)研究報(bào)告顯示：遺傳因素有種族和地域差異，CYP2C19功能缺失等位基因攜帶者的頻率在高加索白種人群中占35%～45%，在非裔黑種人群中占25%～35%，在亞洲黃種人群中占50%～70%，其頻率是高加索白種人群的近2倍[27]。因此亞洲人更應(yīng)據(jù)CYP2C19基因檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)其個(gè)體化治療。

8展望

血小板聚集功能檢測(cè)的意義不僅是在顯著降低缺血事件發(fā)生率同時(shí)不增加出血發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，更是為了找到血小板抑制作用的最佳界值點(diǎn)[28]。如今血小板聚集功能檢測(cè)的方法已從傳統(tǒng)的手工法轉(zhuǎn)變成全自動(dòng)儀器法，從較早的比濁法轉(zhuǎn)變成流式細(xì)胞術(shù)、剪切誘導(dǎo)血小板聚集測(cè)定法、血栓彈力圖等，從應(yīng)用富含血小板血漿( PRP) 樣本轉(zhuǎn)變成以全血為樣本，從單一的檢測(cè)血小板聚集功能轉(zhuǎn)變成可同時(shí)測(cè)定血小板內(nèi)Ca2+含量和血小板釋放 ATP，從實(shí)驗(yàn)室到床旁檢測(cè)法。

雖然目前血小板聚集功能測(cè)試的方法有很多種，但因?yàn)闄z測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)不同，各種試驗(yàn)方法各有利弊，所以迄今為止國(guó)內(nèi)外對(duì)抗血小板治療反應(yīng)多樣性的臨床檢測(cè)和處理仍無(wú)一致意見(jiàn)。結(jié)合目前已經(jīng)公布的多個(gè)大型研究所得到的結(jié)論不推薦對(duì)血小板聚集功能行常規(guī)檢測(cè)指導(dǎo)個(gè)體化治療。因此無(wú)論是2013年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)基金會(huì)(ACCF)/ 美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AHA)STEMI 指南[29]，還是2012 年 ACCF/AHA[30]及2011 年歐洲心臟病學(xué)會(huì) (ESC) 的非 ST 段抬高冠狀動(dòng)脈綜合征 (NSTE-ACS)指南[31]一致認(rèn)為目前血小板聚集功能檢測(cè)的作用尚未明確，不建議常規(guī)使用。我國(guó)專家共識(shí)提出：對(duì)常規(guī)劑量氯吡格雷治療時(shí)發(fā)生了支架血栓或血栓事件如心肌梗死；臨床和介入手術(shù)結(jié)果預(yù)測(cè)血栓風(fēng)險(xiǎn)明顯增高(如肥胖、糖尿病、腎功能不全、術(shù)中出現(xiàn)夾層、無(wú)復(fù)流等)；左主干、單支開放血管(左主干等同病變)、多支血管病變、橋血管病變及彌漫病變需多枚支架重疊置入等高危病變PCI術(shù)后等高危人群提供相應(yīng)血小板聚集功能檢測(cè)[32]。近期一些研究報(bào)道 CYP2C19 酶功能缺失變體的等位基因載體以及細(xì)胞色素 P450 同種型參與了氯吡格雷的新陳代謝，成為它的活性代謝物，導(dǎo)致缺血事件發(fā)生率增加。相信在不久的將來(lái)，最佳的預(yù)測(cè)缺血事件和出血等臨床結(jié)果的模型是基因基礎(chǔ)(如 CYP2C19)和血小板功能測(cè)試的聯(lián)合使用綜合評(píng)價(jià)。

血小板抑制作用最理想的范圍會(huì)因不同人群，不同病情而變化的，這些個(gè)體化的抗血小板治療方案則是急需研究解決的問(wèn)題。另外迫切需要將來(lái)血小板聚集功能的檢測(cè)方法朝著更精確、便捷，多功能的方向發(fā)展，從而在臨床疾病的診斷和治療過(guò)程中發(fā)揮更有價(jià)值的指導(dǎo)作用，尤其據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)冠心病及行PCI術(shù)后病人提供個(gè)體化治療和減低心血管血栓事件的發(fā)生率。

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(本文編輯王雅潔)

主要責(zé)任者是指對(duì)文獻(xiàn)的知識(shí)內(nèi)容或藝術(shù)內(nèi)容負(fù)主要責(zé)任的個(gè)人或團(tuán)體。主要責(zé)任者包括著者、專利申請(qǐng)者或?qū)＠姓咭约皡R編本的編者等。

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例1：1李時(shí)珍(原題：李時(shí)珍)

2Einstein A(原題：Albert Einstein)

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例：1馬克思，恩格斯

2Yelland RL,Jones SC,Eaxton KS,et al.

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《中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志》編輯部

(收稿日期：2015-06-11)

中圖分類號(hào)：R541R256

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.07.014

文章編號(hào)：1672-1349(2016)07-0713-05

通訊作者：安健，E-mail：anjianer@126.com