榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系的發(fā)掘與應(yīng)用

陳偉陳磊楊仕明1中國人民解放軍總醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科（北京10085）2中國人民解放軍空軍總醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科（北京10006）重慶市畜牧科學(xué)院（重慶402460）

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榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系的發(fā)掘與應(yīng)用

陳偉1，2陳磊3楊仕明*1
1中國人民解放軍總醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科（北京100853）
2中國人民解放軍空軍總醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科（北京100036）
3重慶市畜牧科學(xué)院（重慶402460）

【摘要】豬作為繼小鼠之后的又一類模式動物，正受到包括比較生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、畜牧學(xué)等在內(nèi)的多領(lǐng)域科學(xué)家的高度關(guān)注。本文主要介紹我國特有的榮昌豬品系中的一個變異群體－“榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系”，其突變位點(diǎn)，病理表現(xiàn)和發(fā)病規(guī)律與人類Waardenburg綜合征2A型極為相似。此家系在聽覺醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用為研究感音神經(jīng)性耳聾的干細(xì)胞移植，早期基因干預(yù)治療、聽覺植入等創(chuàng)造了條件。為聽覺醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究提供了理想的大型哺乳動物模型。

【關(guān)鍵詞】榮昌豬；動物模型；聽覺醫(yī)學(xué)

Financial funds：This work was supported by grants from the National.Basic Research Program of China (973 Program) (#2012CB967900；2011CBA01000),the National Natural Science Foundation of China (NSFC #81271082).Special Cultivating and Developing,Program of Beijing Science and Technology Innovation Base.Competing Interests:The authors have declared that no competing interests exist.

動物模型在生物醫(yī)學(xué)研究中的地位極其重要。成功的動物模型有助于更方便、有效地認(rèn)識人類疾病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律和研究防治措施。傳統(tǒng)耳科研究領(lǐng)域的常用動物模型主要是嚙齒類動物。這些動物體型較小，易操作，但其內(nèi)耳體積較小，發(fā)育成熟較晚，解剖結(jié)構(gòu)與人類相差甚遠(yuǎn)，種種原因阻礙了此動物模型在耳科領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。豬是實(shí)驗(yàn)動物中除靈長類外和人類進(jìn)化關(guān)系最近的物種，與人類在解剖、基因及病理生理學(xué)上相似，尤其是中耳、內(nèi)耳各器官的解剖結(jié)構(gòu)與人類很相似，體積相對較大，在形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)研究方面更加直觀[1]。因此，豬可能成為耳科研究的最理想實(shí)驗(yàn)動物，在耳科學(xué)領(lǐng)域具有重要的實(shí)用價值。本文主要介紹我國特有的榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系的發(fā)現(xiàn)經(jīng)過，鑒定過程，展示榮昌豬作為耳科學(xué)領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)動物模型的優(yōu)勢。同時介紹榮昌豬耳聾家系動物模型在耳科領(lǐng)域,包括聾病的機(jī)制，干細(xì)胞治療相關(guān)基礎(chǔ)研究、聽覺植入相關(guān)研究等方面的應(yīng)用現(xiàn)狀。

1　豬作為耳科動物模型的優(yōu)勢

豬是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中除靈長類以外和人類進(jìn)化關(guān)系最近的物種。家豬作為繼小鼠之后的又一類模型動物，正受到包括比較生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、畜牧學(xué)等在內(nèi)的多領(lǐng)域科學(xué)家的高度關(guān)注，解剖結(jié)構(gòu)、進(jìn)化速率和代謝率等方面的差異造成鼠作為人類聽力缺陷動物模型的再現(xiàn)性和可靠性較差，然而這些方面恰好是家豬模型的優(yōu)勢。相關(guān)的一系列前沿生物技術(shù)與基礎(chǔ)數(shù)據(jù)正日新月異的發(fā)展，這更為豬作為聽力相關(guān)疾病的動物模型研究提供了良好的前提條件。

耳聾是一種嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的感覺障礙性疾病,在世界范圍內(nèi),大約每1000名新生兒中就有1名先天性耳聾患兒,其中50%患兒的耳聾與遺傳因素有關(guān)[2]。耳聾基因與遺傳性耳聾關(guān)系密切，目前發(fā)現(xiàn)，人類基因組中有200多個基因與耳聾相關(guān)[3、4]。遺傳性耳聾的基因篩查、致病機(jī)理和基因治療手段等方面一直是耳科研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由于人類顳骨標(biāo)本的取材限制以及在人體進(jìn)行相關(guān)聽功能、電生理檢測的局限性，使得動物模型成為研究聽覺相關(guān)遺傳疾病的必要工具[5、6]。小鼠、大鼠、豚鼠等嚙齒類動物是最常見的聽覺研究動物模型，但這些小型哺乳動物的內(nèi)耳解剖、發(fā)育和體積與人類相差甚遠(yuǎn)[7]，并且從胚胎期開始其個體發(fā)育模式與人類存在巨大的差異，因此一些發(fā)育性的疾病無法在鼠模型上再現(xiàn)。在遺傳性聽力缺陷研究方面，目前亟待突破的毛細(xì)胞再生、人工聽力重建、早期聽力挽救等方面的研究均無法深入開展[8]?？梢?在遺傳性耳聾的病理機(jī)制及防治研究中，特別需要大型哺乳動物模型參與。而豬就是一類理想的模型動物。

在解剖學(xué)和形態(tài)學(xué)方面，豬與人類相比具有極高的相似性。豬中耳和內(nèi)耳解剖研究發(fā)現(xiàn)豬與人在聽覺器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu)方面具有極高的相似性。如豬的中耳腔形態(tài)和咽淋巴組織結(jié)構(gòu)均與人類高度一致，非常適合作為中耳炎模型[9]。豬耳蝸骨壁的厚度、強(qiáng)度與人更為接近，可以被應(yīng)用于耳蝸開窗術(shù)[10]。耳蝸精細(xì)斷層掃描顯示豬的耳蝸結(jié)構(gòu)與人類高度相似[11]。此外豬內(nèi)耳形態(tài)在出生時已基本發(fā)育成熟，并具備正常聽力。在遺傳學(xué)和基因組學(xué)方面，豬與人類也有非常相近的進(jìn)化關(guān)系。豬與人的基因組大小相近，基因數(shù)量和基因結(jié)構(gòu)類似。大量的人類致病基因能夠在豬基因組中找到同源基因，這些基因的突變在人和豬上都能產(chǎn)生類似的遺傳效應(yīng)和病理表型。隨著下一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，豬基因組數(shù)據(jù)也越來越完善。2010年11月新版基因組數(shù)據(jù)—Sus Scrofa 10.0公布,共包含2.62Gb的數(shù)據(jù)，其測序深度從9.0版的4X增加到40X，基因組覆蓋度大大增加，極大加快了豬基因組學(xué)研究的步伐。隨后大量的豬基因組測序數(shù)據(jù)被報道出來，至今為止已經(jīng)有至少3個完整的豬參考基因組問世，分別代表了不同類型的豬品種。因此豬作為動物模型在耳科領(lǐng)域應(yīng)用前景十分廣闊。

2　榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系的發(fā)現(xiàn)與鑒定

榮昌豬是我國不可多得的寶貴地方豬品種資源，除具有肉質(zhì)優(yōu)良、繁殖性能好、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)等地方豬種的一般優(yōu)良特性外，它還是我國地方豬種中唯一的以白色皮毛為主的品種。典型的榮昌豬毛色是軀體全白，頭部眼圈周圍有面積不等的黑色皮膚和毛發(fā)，即所謂的“黑眼膛”毛色，這是其最著名的品種特征，因此榮昌豬又被稱作“眼鏡豬”、“熊貓豬”。

在榮昌豬保種繁殖過程中，發(fā)現(xiàn)榮昌豬群體內(nèi)偶爾會出現(xiàn)黑眼圈消失的純白個體，研究發(fā)現(xiàn)這些個體存在多方面的遺傳缺陷：

首先是色素沉積異常，這種純白榮昌豬個體除了毛（膚）色方面異常外，還表現(xiàn)出虹膜變淺的特征，其角膜瞳孔外區(qū)域較普通榮昌豬的棕色更淺，呈淺藍(lán)色；其次還表現(xiàn)出聽生理異常，純白榮昌豬個體均表現(xiàn)出先天性的聽力缺陷，對聲音刺激沒有反應(yīng)，在生產(chǎn)管理的過程中造成諸多不便，如容易壓死仔豬、驅(qū)趕轉(zhuǎn)移困難等。客觀電生理測定腦干聽覺誘發(fā)電位（ABR）結(jié)果表明參測的所有純白榮昌豬在各頻率的儀器最大輸出均不能引出ABR波形，表現(xiàn)出重度耳聾。此外還出現(xiàn)了內(nèi)耳感覺上皮形態(tài)的異常，全耳蝸基底膜鋪片和內(nèi)耳掃描電鏡結(jié)果表明，純白榮昌豬耳蝸外毛細(xì)胞大量消失，內(nèi)毛細(xì)胞雖然存在但纖毛融合。這種毛細(xì)胞的缺失和纖毛的融合正是導(dǎo)致耳聾的直接原因。

遺傳分析結(jié)果表明，純白個體表現(xiàn)的這些遺傳缺陷表型符合常染色體單基因隱性性狀的遺傳規(guī)律。因此將榮昌豬中出現(xiàn)的這個變異群體命名為“榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系”，同時將攜帶這種遺傳缺陷和突變基因的純白榮昌豬命名為Mitf-/-，而正常野生型個體為Mitf+/+。隨后利用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法將耳聾性狀突變基因定位于13號染色體約74M附近的一段700K的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間中只有一個已注釋的基因Mitf，因?yàn)樵摶虻耐蛔冊谌?、牛、鼠、馬等物種中均導(dǎo)致聽力-色素綜合征，因此確定該基因就是導(dǎo)致榮昌豬耳聾的致病基因。為了確定具體的致病突變，對Mitf基因進(jìn)行了突變篩查。對該基因的所有外顯子和部分非編碼調(diào)控區(qū)域的分析一共發(fā)現(xiàn)了21個與白化、耳聾性狀共分離的突變，其中只有一個同義突變發(fā)生在編碼區(qū)內(nèi)，其他的突變均發(fā)生在基因的內(nèi)含子和啟動子中間。

表達(dá)譜分析表明在出生前后的各個發(fā)育階段，Mitf-/-個體的Mitf-M表達(dá)量均出現(xiàn)了消失的現(xiàn)象，而Mitf-A和Mitf-H均未受到影響。而Mitf-M是特異性表達(dá)在黑色素細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄變異體，他是黑色素細(xì)胞生存、遷移的特異性調(diào)控因子。因此我們認(rèn)為，致病突變的遺傳效應(yīng)是導(dǎo)致Mitf-M特異性的表達(dá)消失，從而造成血管紋中間層細(xì)胞和全身黑色素細(xì)胞的缺失，進(jìn)而導(dǎo)致耳聾、白化表型。

以上推測，致病突變應(yīng)該與且僅與Mitf-M的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，因此將致病突變的范圍縮小到Mitf-M特異性的調(diào)控因子M啟動子（M-promoter）中，在21個共分離的突變中，有8個位于該區(qū)域。利用雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)，對這些突變在轉(zhuǎn)錄活性方面的遺傳效應(yīng)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，位于Mitf-M轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約7.6kb處的兩處插入突變和一個雙堿基置換對M啟動子的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生了顯著的影響，因此致病突變的范圍進(jìn)一步縮小到這三處突變中。隨后，利用EMSA實(shí)驗(yàn)分析了這三處突變對與DNA-蛋白結(jié)合能力的影響，結(jié)果表明，其中一個14bp的插入突變，導(dǎo)致了新的蛋白結(jié)合活性，而其余兩處突變對于該片段的蛋白結(jié)合能力沒有影響。因此最終將致病突變確定為位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游7651bp處的一處14bp插入，該突變產(chǎn)生了一個新的Sox家族轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，對Mitf-M的轉(zhuǎn)錄起到了負(fù)調(diào)控的作用。

至此，成功確定了Mitf基因的啟動子區(qū)域內(nèi)的一個14bp的插入突變是導(dǎo)致榮昌豬遺傳性聽力缺陷的致病突變，明確了這種遺傳疾病的致病機(jī)理與發(fā)病規(guī)律。建立了一種新的人類遺傳性神經(jīng)性聽力缺陷的大型哺乳動物模型。

3　人工耳蝸臨床試驗(yàn)平臺的構(gòu)建

據(jù)國內(nèi)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，目前我國聽力言語殘疾者達(dá)2800萬之多，并仍以每年3萬聾兒的速度在增長。其中，感音神經(jīng)性耳聾占絕大多數(shù)，目前最佳的治療手段為人工耳蝸植入。自1984年美國FDA正式批準(zhǔn)多導(dǎo)電子耳蝸在成人應(yīng)用至今，全世界已有30萬聾人通過植入電子耳蝸而重新獲得聽力。這其中包括10萬先天性耳聾的兒童，得益于此技術(shù)而回到有聲世界，并開啟了與正常兒童同樣精彩的人生。

但是，電子耳蝸并不能解決所有耳聾患者的苦惱，如感染造成的雙側(cè)耳聾，常因耳蝸骨化、纖維化造成電極插入困難；聽神經(jīng)病患者，其電子耳蝸植入后的效果難以預(yù)料；雙側(cè)聽神經(jīng)瘤?。∟F2）患者，切除腫瘤的同時也喪失了耳蝸植入的機(jī)會，不得不接受風(fēng)險極大，效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及電子耳蝸植入的聽覺腦干植入治療。與此同時，植入電子耳蝸的耳聾患者，也還有眾多疑問不能解答。如大齡語前聾患兒，長期處于言語剝奪狀態(tài)下，其電子耳蝸植入后效果很差，針對此類患者，如何進(jìn)行耳蝸電極參數(shù)的個性化調(diào)整，無據(jù)可依；言語識別能力與植入電極位置、長度、通道數(shù)量的關(guān)系，仍不清楚。而這些都急切需要大型哺乳動物模型參與，其中豬就是一類理想模型動物。因此利用榮昌豬建立人工耳蝸試驗(yàn)、測試及開發(fā)平臺勢在必行。

通過前期對榮昌豬內(nèi)耳顯微CT測量數(shù)據(jù)顯示，其耳蝸鼓階可以容納人類現(xiàn)用人工耳蝸電極，無需額外改制電極[11]。在對榮昌豬中耳、內(nèi)耳解剖充分研究后，我們創(chuàng)建了耳后切口，面神經(jīng)隱窩進(jìn)路，圓窗入路的電極植入方式，植入體固定在顱頂。同時創(chuàng)建了顱頂縫合保護(hù)罩加防護(hù)外衣的方式給榮昌豬佩戴體外機(jī)。術(shù)后影像學(xué)檢查顯示電極插入位置良好，位于小型豬耳蝸第一、二轉(zhuǎn)的鼓階內(nèi)。對耳蝸損傷輕微，植入位置良好，術(shù)中及術(shù)后EABR波形記錄良好。與傳統(tǒng)的動物模型相比，榮昌豬內(nèi)耳解剖與人類相似，人工耳蝸電極不需要特殊制備，更加貼近臨床試驗(yàn)要求，非常適合作為新型的人工耳蝸植入動物模型。

這一平臺的建立具有指導(dǎo)耳蝸植入電極參數(shù)改進(jìn)，新型植入電極設(shè)計(jì)制造的臨床應(yīng)用價值。很可能會帶來電子耳蝸植入電極的極大改進(jìn)，甚至突破性進(jìn)展，如帶有誘導(dǎo)聽覺神經(jīng)定向生長功能的電極。從而使目前的電子耳蝸植入難題，如耳蝸畸形，耳蝸纖維化等得以解決，使更多的患者受益。具有廣闊的應(yīng)用前景，及良好的社會、經(jīng)濟(jì)效益。

4　耳蝸干細(xì)胞移植療法的探索

針對耳蝸毛細(xì)胞和(或)聽覺初級傳入神經(jīng)元一螺旋神經(jīng)元的退變或缺失的疾病根本。各國科學(xué)家正研究一種全新的治療方法—干細(xì)胞移植。隨著干細(xì)胞技術(shù)快速發(fā)展，該方法在動物模型中已取得可喜的進(jìn)展[12,13]，但對于移植徑路方面，如何在使內(nèi)耳結(jié)構(gòu)功能損傷程度最小化的基礎(chǔ)上，將細(xì)胞移植到距離損傷部位最近的位置或者直接移植到損傷部位；同時在干細(xì)胞移植后如何驅(qū)動或誘導(dǎo)其到達(dá)治療的靶向區(qū)域，仍需進(jìn)一步的研究與探索。

本課題組的前期研究，建立了正常榮昌豬內(nèi)耳解剖、手術(shù)方式以及形態(tài)、聽功能數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)豬的內(nèi)耳和人類及其他動物相比在功能和形態(tài)上既具有相似性又存在差異；同時對白化耳聾榮昌豬進(jìn)行家系構(gòu)建和基因分析，確定精確的致病基因?yàn)镸itf-M基因，使得此耳聾動物家系遺傳背景清楚，可以作為耳聾疾病的大型哺乳動物模型應(yīng)用于耳科領(lǐng)域的研究；利用從胚胎到出生后不同發(fā)育階段的自發(fā)突變型白化榮昌豬（Mitf-/-）和正常野生型榮昌豬（Mitf+/+）內(nèi)耳形態(tài)學(xué)和聽功能的比較分析，發(fā)現(xiàn)白化榮昌豬的耳聾是由Mitf-M基因突變導(dǎo)致內(nèi)耳血管紋病理變化引起的，最終引發(fā)血管紋中間細(xì)胞消失，內(nèi)耳鉀離子濃度和耳蝸內(nèi)電位的變化，導(dǎo)致ABR異常，聽功能喪失，闡述了Mitf-M基因突變引發(fā)耳聾的病理機(jī)制。使我們進(jìn)一步明確了胚胎發(fā)育過程中Mitf-M對血管紋和黑色素細(xì)胞發(fā)生作用的關(guān)鍵時間點(diǎn)和變化規(guī)律。這可能也是人類Waardenburg綜合征2A型及Tietz綜合征所致耳聾癥狀的原因。為研究人類Waardenburg綜合征2A型感音神經(jīng)性耳聾的干細(xì)胞移植，早期基因干預(yù)治療、人工聽力重建、毛細(xì)胞再生等提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為人類Waardenburg綜合征2A型耳聾的研究提供了理想的大型哺乳動物模型。

比較正常榮昌豬與基因突變耳聾榮昌豬的內(nèi)耳超微結(jié)構(gòu)，可以發(fā)現(xiàn)在出生后13天的耳聾豬耳蝸內(nèi)，其中階塌陷，并與前庭階貫通、融合。這對我們選擇干細(xì)胞移植的途經(jīng)提供了重要的解剖信息。并且Mitf-M基因突變耳聾榮昌豬內(nèi)耳血管紋病理變化，導(dǎo)致中階的高鉀環(huán)境消失，這對于干細(xì)胞移植是很有利的微環(huán)境。

本研究選擇耳后入路，圓窗膜注射的移植途經(jīng)。選用人來源的iPSCs（GFP標(biāo)記）作為移植干細(xì)胞。所有動物均選擇右耳為手術(shù)移植側(cè)，左耳為對照側(cè)。術(shù)前、術(shù)后即刻、術(shù)后1周測量聽覺生理指標(biāo)（聽覺腦干誘發(fā)電位，ABR）。觀察圓窗入路干細(xì)胞移植途經(jīng)對聽覺功能的影響，以及干細(xì)胞移植后聽覺功能的變化情況。利用耳蝸冰凍切片，免疫熒光染色法及圖像分析系統(tǒng)定量分析移植后干細(xì)胞存留情況（包括細(xì)胞密度、分布差異、時間梯度變化等）。通過耳蝸冰凍切片，免疫熒光染色法，圖像定量分析系統(tǒng)分析干細(xì)胞移植后對內(nèi)耳超微結(jié)構(gòu)（包括螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量、樹突/軸突長度、分支數(shù)量等）的作用影響。手術(shù)步驟：1）麻醉：速眠新0.5ml肌肉注射，10分鐘后連接呼吸機(jī)吸入異氟烷0.2ml/分鐘行全身麻醉。2）體位擺放：榮昌豬右側(cè)臥位，右耳朝上，左耳后海綿墊墊襯固定。3）消毒、鋪單：碘伏消毒右側(cè)耳周及顱頂部，常規(guī)鋪無菌單。4）右耳后切口：右側(cè)耳后，沿耳廓附著緣切口，長約5cm,上自耳廓上端，下至下頜角。切開皮膚、皮下組織，顯露頜下腺，頸部肌群。沿腺體與肌肉間分離，直至乳突骨面。切斷部分肌腱，分離顯露外耳道后壁骨面。緊貼頜下腺，在外耳道后壁用電鉆磨開一個3＊3mm的骨窗。可見外耳道后壁的軟組織，推開后，顯露出鼓膜以及面神經(jīng)，鼓索神經(jīng)，磨除部分外耳道后上壁骨質(zhì)，顯露出砧骨及鐙骨頭。5）顯露耳蝸圓窗：磨除部分面神經(jīng)表面骨質(zhì)，游離面神經(jīng)并向下移位。即可顯露圓窗。6）圓窗內(nèi)注射：將提前準(zhǔn)備好的干細(xì)胞懸液，吸入10ul顯微注射器內(nèi)。刺穿圓窗膜，將干細(xì)胞懸液緩慢注入耳蝸鼓階。間隔30分鐘后，再次注射一次。用明膠海綿填塞圓窗龕。7）縫合切口：逐層縫合切口，手術(shù)結(jié)束。

5　基于活體基因組編輯的基因治療技術(shù)探索

成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)核酸酶9（Cas9）的定向基因組編輯技術(shù)已經(jīng)在研究遺傳性疾病相關(guān)基因功能方面展現(xiàn)巨大的潛力。目前已經(jīng)有通過腺相關(guān)病毒（AAV）將CRIS?PR/Cas9導(dǎo)入活體哺乳動物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因治療的報道[14]。而榮昌豬模型的遺傳缺陷是由一個位于Mitf基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域內(nèi)的Gain-of-function的突變產(chǎn)生的，只需要利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的非同源修復(fù)就能將這個Gain-of-function突變破壞，恢復(fù)Mitf基因的表達(dá)，因此榮昌豬模型是開展基于活體基因組編輯的基因治療技術(shù)的理想模型。

本研究準(zhǔn)備利用AAV將CRISPR/Cas9導(dǎo)入到早期Mitf-/-榮昌豬的內(nèi)耳組織中，以期修復(fù)Mitf基因的突變，實(shí)現(xiàn)基因治療。目前內(nèi)耳組織已經(jīng)成為CRIS?PR/Cas9介導(dǎo)基因治療探索的熱點(diǎn)，Zuris等已經(jīng)利用脂質(zhì)體活體轉(zhuǎn)染的方式，將轉(zhuǎn)基因小鼠模型內(nèi)耳毛細(xì)胞中的GFP基因成功敲除[15]，這說明CRISPR/Cas9在內(nèi)耳中是有廣泛應(yīng)用前景的。首先為了實(shí)現(xiàn)CRIS?PR/Cas9在豬基因組中的高效、定點(diǎn)編輯，利用豬的成纖維細(xì)胞在體外水平篩選出針對榮昌豬突變的一個高效切割位點(diǎn)，基因組編輯的效率可達(dá)到約50%。下一步的工作將集中于CRISPR/Cas9的導(dǎo)入時機(jī)和方式，以及導(dǎo)入后表型變化的測定。

6　聽覺中樞可塑性研究的探索

中樞神經(jīng)系統(tǒng)常常由于外周神經(jīng)活動而產(chǎn)生可塑性的改變，這個反應(yīng)機(jī)制就是所謂的“活動依賴可塑性”。聽覺剝奪后以及給予受損的外周聽覺感受器-耳蝸內(nèi)電刺激(相當(dāng)于聲刺激)后，聽覺中樞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，即發(fā)生可塑性的改變或重組。語前聾或語后聾的感音神經(jīng)性聾患者在聾后或人工聽覺植入后聽覺中樞可出現(xiàn)類似的可塑性改變。

應(yīng)用大型哺乳動物研究聽覺中樞可塑性是近來聽覺研究的熱點(diǎn)。榮昌豬耳聾家系模型在此方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。首先本家系是自然育種形成的基因缺陷耳聾家系，與人類基因缺陷導(dǎo)致的先天性耳聾家系有良好的可比性；其次前期的研究已經(jīng)明確導(dǎo)致耳聾的基因缺陷，家系的遺傳背景清晰，便于對比分析研究；而且應(yīng)用同一窩出生的榮昌豬模型進(jìn)行干預(yù)研究，可以使中樞可塑性研究的參雜因素降到最低，得出的結(jié)果更有說服力。

為此，設(shè)計(jì)了初步的實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)對象：正常榮昌豬（聽力正常6只），右耳植入電子耳蝸的白化榮昌豬（p30天3只，p100天3只），同一窩的白化耳聾榮昌豬（p30天3只，p100天3只）。擬觀察內(nèi)容：（1）正常榮昌豬聽覺通路Bold-fMRI成像，觀察蝸神經(jīng)核，上橄欖核，下丘，內(nèi)側(cè)膝狀體，聽覺皮層在不同頻率純音（500Hz,4000Hz）刺激下的激活情況。（2）耳蝸植入后的白化榮昌豬（p30天2只，p100天2只），聽覺通路Bold-fMRI成像，觀察蝸神經(jīng)核，上橄欖核，下丘，內(nèi)側(cè)膝狀體，聽覺皮層在不同頻率純音（500Hz,4000Hz）刺激下的激活情況。相互比較，并與正常聽力豬比較。（3）利用H-MRS技術(shù)觀察正常榮昌豬純音刺激前后聽覺皮層代謝情況變化。觀察雙側(cè)聽皮層N一乙酰天門冬氨酸(N—aceytlaspartate，NAA)、肌酸(creatine．Cr)、膽堿(choline，Cho)、谷氨酰胺和谷氨酸(glutamate／glutamine，Glx)等代謝物的波峰變化并進(jìn)行半定量分析。（4）利用H-MRS技術(shù)觀察耳蝸植入后的白化榮昌豬（p30天2只，p100天2只）純音刺激前后聽覺皮層代謝情況變化。觀察雙側(cè)聽皮層N一乙酰天門冬氨酸(N—aceytlaspartate，NAA)、肌酸(creatine．Cr)、膽堿(choline，Cho)、谷氨酰胺和谷氨酸(glutamate／glutamine，Glx)等代謝物的波峰變化并進(jìn)行半定量分析。相互比較，并與正常聽力豬比較。（5）正常榮昌豬，白化榮昌豬的MRI內(nèi)耳水成像（3D成像）。（6）人工耳蝸植入后榮昌豬的MRI內(nèi)耳水成像（3D成像）。

但是應(yīng)用功能核磁共振成像技術(shù)存在的問題尚待解決，如植入體在磁場環(huán)境下的移位問題，核磁共振設(shè)備的背景噪聲過大影響聽覺皮層反射問題等。我們的后備方案是應(yīng)用PET-CT技術(shù)，可以解決磁場干擾和噪聲過大的問題。

7　應(yīng)用展望

豬作為理想的實(shí)驗(yàn)動物模型已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研究領(lǐng)域，一方面是應(yīng)用猴等高級哺乳動物存在倫理學(xué)上的限制，另一方面是基于人們對豬與人類在解剖和功能方面相似性的認(rèn)識逐步加深[16]。發(fā)掘的榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系，在聽覺基礎(chǔ)研究以及臨床遺傳性聾疾病相關(guān)研究方面的應(yīng)用前景十分廣闊。以此為基礎(chǔ)建立的人工耳蝸植入的大型哺乳動物實(shí)驗(yàn)平臺，干細(xì)胞治療遺傳性耳聾實(shí)驗(yàn)平臺，基因治療遺傳性耳聾實(shí)驗(yàn)平臺，為更加直接地研究臨床相關(guān)的人工耳蝸植入設(shè)備在體內(nèi)的工作狀態(tài)和各項(xiàng)數(shù)據(jù)，研究內(nèi)耳植入耳蝸后的生理病理改變創(chuàng)造了條件。這些研究很可能會帶來電子耳蝸植入設(shè)備的極大改進(jìn)，甚至突破性進(jìn)展。從而使目前的聽覺植入難題得以解決，使更多的患者受益。因此，榮昌豬遺傳性聽力缺陷家系實(shí)驗(yàn)動物模型的深入開發(fā)和應(yīng)用不僅具有觀察分析大型哺乳動物內(nèi)耳生物學(xué)行為及其機(jī)制的科學(xué)價值，而且具有基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)向臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用轉(zhuǎn)化研究的臨床應(yīng)用價值。具有極其廣闊的應(yīng)用前景，及良好的社會、經(jīng)濟(jì)效益。

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·聽覺研究新模型專輯·

Excavation and application of the Rongchang Pig hereditary pedigree connected to hearing defects

CHEN Wei1,2,CHEN Lei3,YANG Shiming*1
1 Department of Otolaryngology,Head & Neck Surgery,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China.
2 Department of Otolaryngology,Head & Neck Surgery,Chinsese PLA Air Force General Hospital,Beijing 100036,China.3 Chongqing Academy of Animal Science,Chongqing 402460,China.Corresponding author：YANG Shiming Email:yangsm301@263.com

【Abstract】As a different class of animal model from mice,pig is being highly valued in areas including comparative biology,developmental biology,medical genetics and animal husbandry.Our representation describes a variation of the unique Rongchang pig strain－Rongchang hereditary pedigree connected to hearing defects .The mutation sites,pathology and pathogenesis are very similar to those in human Waardenburg syndrome type 2A.Application of this pedigree,in the field of hearing research,benefits the study on treatment of neurosensory hearing loss with stem cell transplantation,early genetic intervention,auditory device implantation,etc.Moreover,it provides an ideal model of large mammals with respect to hearing medicine sciences.

【Key words】Rongchang pig; animal model; hearing medicine science

收稿日期：（2015-12-28）

通訊作者：楊仕明，Email:yangsm301@263.com

作者簡介：陳偉，博士在讀，副主任醫(yī)師，研究方向：電子耳蝸植入相關(guān)研究，內(nèi)耳基因及干細(xì)胞治療相關(guān)聽覺醫(yī)學(xué)研究

基金項(xiàng)目：國家973計(jì)劃重大科學(xué)問題導(dǎo)向項(xiàng)目（2011CBA01000）；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81271082）；國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81400472）；北京科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展專項(xiàng)；重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（11611，14440）

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.003

【中圖分類號】R764

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）01-10-5