生物芯片技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病應(yīng)用方面的研究進(jìn)展

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(南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 郴州 423000)

·文獻(xiàn)綜述·

生物芯片技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病應(yīng)用方面的研究進(jìn)展

李碩馳，李海鵬，湯海亮，張茜，黃仁彬

(南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 郴州 423000)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染在診斷和治療上存在很多難點(diǎn)，而生物芯片技術(shù)可將大量的探針同時(shí)固定于支持物上，滿足大量的生物分子進(jìn)行檢測分析的需要，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。本文主要就生物芯片技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病病原的檢測和診斷、耐藥性的分析和致病機(jī)制的研究進(jìn)行綜述。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染； 基因芯片； 蛋白芯片； 懸液芯片

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是指腦實(shí)質(zhì)、脊髓及其周圍部位受到一種或多種病原微生物的入侵所致的神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，其重癥患者病死率高，常導(dǎo)致不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病有多種分類方式，可按炎性反應(yīng)部位、發(fā)作的急緩、入侵的途徑、流行特征以及病原學(xué)的種類來分類，而在臨床中確診疾病通常以病原學(xué)診斷為標(biāo)準(zhǔn)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染按照病原類型大致可分為細(xì)菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、螺旋體感染、寄生蟲感染等。目前，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷和治療一直困擾著廣大臨床醫(yī)生并且存在許多的難題，首先，中樞神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)造復(fù)雜、其癥狀又缺乏明顯特異性，快速確診存在困難；其次，其病原種類極多，即使確診，也不易明確感染患者的病原菌。如今精準(zhǔn)醫(yī)療是醫(yī)療發(fā)展的趨勢，也就是要制定與患者分子生物病理學(xué)特征相匹配的個(gè)體化診斷和治療策略，因此務(wù)需去盡早明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的病原菌、作用機(jī)制，以使患者得到更加精準(zhǔn)化的治療，盡早恢復(fù)健康。

目前對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相關(guān)性疾病的病原學(xué)檢測方法包括如大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)仍作為主要手段的腦脊液病原菌培養(yǎng)、分離技術(shù)以及分子診斷技術(shù)如PCR、real-timePCR、ELISA、基因測序等。但上述方法都有著各自的明顯缺點(diǎn)，培養(yǎng)分離技術(shù)耗時(shí)長、陽性率低，PCR、ELISA不能同時(shí)檢測多種病原體，基因測序技術(shù)成本高、步驟繁瑣，暫時(shí)不利于大批量應(yīng)用[1]。而生物芯片技術(shù)具有高通量、低成本、微型化、效率高、精確度高等特點(diǎn)，為研究感染性疾病提供了新的思路和方法。

生物芯片技術(shù)是90年代中期以來影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一，是融合微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，有著重大的研究價(jià)值與前景[2]。生物芯片主要分為：(1)基因芯片技術(shù)(GeneChip)又稱DNA微陣列(DNAmicroarray)，是最早出現(xiàn)的生物芯片技術(shù)。基因芯片與計(jì)算機(jī)芯片類似，但前者由成千上萬的基因探針有序地高度集成而來，其技術(shù)主要包括5個(gè)環(huán)節(jié)：矩陣的構(gòu)建、探針的準(zhǔn)備、探針與矩陣的雜交、掃描和檢測、標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)分析[3]。(2)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，其與基因芯片的基本原理相同，但它利用的不是堿基配對而是抗體與抗原的特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)來檢測[4]。(3)液相芯片技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)是由美國Luminex公司研制的新一代生物芯片技術(shù)，它將芯片技術(shù)與流式檢測聯(lián)系起來，極大地延伸了流式檢測平臺[5]。生物芯片技術(shù)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病病原的檢測和診斷、耐藥性的分析和致病機(jī)制的研究提供了一個(gè)有效而強(qiáng)大的武器。

1 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原檢測和診斷中的應(yīng)用

在基因芯片的研究中，Díaz-BadilloA等[6]建立了一種DNA微陣列可以檢測兩種不同型別登革熱病毒的雙重感染，并且證明其具有較高的敏感性和特異性；LiuY等[7]開發(fā)了一種芯片,該芯片可以同時(shí)檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的皰疹病毒和腸道病毒，包括HSV-1、HSV-2、EB病毒、巨細(xì)胞病毒、EV-71、柯薩奇病毒A16和B5。這項(xiàng)研究提供了一個(gè)能同時(shí)提取，擴(kuò)增，雜交和檢測DNA病毒和RNA病毒的創(chuàng)新方法，在臨床研究中有一定意義。HuangW等[8]設(shè)計(jì)了一個(gè)EOPM(EasyOperatingPathogenMicroarray)芯片平臺，該芯片具有約6萬條探針，根據(jù)病原菌的基因組序列可以快速檢測大部分已知的病原菌，并且自主開發(fā)了一款針對此平臺的基因芯片分析軟件，大大減少了分析時(shí)間，其中在使用特異性引物的情況下，在RNA拷貝數(shù)為1012的人體細(xì)胞中，腸道道病毒RNA拷貝數(shù)如果大于1000，即可被系統(tǒng)檢測到。

在蛋白芯片的研究中：早在2002年，MezzasomaL等[9]利用風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒1型和2型作為診斷抗原，依據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合的原理,制備成抗體蛋白質(zhì)芯片,并使用芯片同時(shí)檢測這幾種病原體，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的ELISA法結(jié)果相似。肖學(xué)文[10]使用蛋白芯片法對160例肺結(jié)核病患者、119例其它疾病患者，279例健康體檢患者進(jìn)行檢測，得出蛋白芯片法檢測肺結(jié)核病的敏感性顯著高于抗酸菌涂片，而特異性稍低，具有簡便、快速等特點(diǎn)。Kang X等[11]開發(fā)了一種同時(shí)檢測包括日本腦炎病毒、東方馬腦炎病毒在內(nèi)的五種腦炎病毒的ELISA陣列，并證明了該陣列較高的可靠性。

在液相芯片的研究中：Bovers M[12-13]團(tuán)隊(duì)先使用液相基因芯片技術(shù)從各類隱球菌性腦膜炎患者腦脊液中鑒定各種隱球菌屬的基因類型，之后該團(tuán)隊(duì)還通過該技術(shù)檢測腦脊液中的奈瑟雙球菌、埃希氏菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌、單純皰疹病毒1型、2型、水痘帶狀皰疹病毒等病原體的核酸，由此達(dá)到能夠同時(shí)高通量篩查診斷各種類型的腦炎和腦膜炎的目的。Foord AJ等[14]在日本腦炎病毒的檢測及分型的研究中，通過液相芯片技術(shù)，建立了JEV 檢測及分型系統(tǒng)，為臨床 JEV 感染的診斷及流行病學(xué)監(jiān)測提供了新的途徑；并證明其操作簡便的同時(shí)，具有較高靈敏度和特異性。石瑩等[15]通過制備特異性單克隆抗體，用生物素標(biāo)記后并將其固定于微球表面，建立起日本乙型腦炎病毒、登革熱病毒等5種蟲媒病毒的多重微球芯片檢測技術(shù)，結(jié)果顯示該技術(shù)不僅與ELISA有著相近的特異性，并且有著高通量、高敏感性、檢測速度更快等優(yōu)點(diǎn)。劉暢等[16]人以豬囊尾蚴華支睪吸蟲的特異性ITS基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)并合成探針及引物,之后對構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測序,建立一種基于雙重PCR的液相基因芯片檢測方法，并為寄生蟲感染性疾病提供了新的診斷思路。

2 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病病原的耐藥基因檢測的應(yīng)用

耐藥性是指病原體對治療藥物敏感性降低的一種狀態(tài)，其主要原因有產(chǎn)生滅活酶、細(xì)菌胞膜透性的改變、細(xì)菌體內(nèi)靶位結(jié)構(gòu)的改變等，其機(jī)制多由于染色體、質(zhì)粒等通過不同途徑獲得外源新基因而產(chǎn)生。目前由于抗生素的濫用、患者服藥依從性差、細(xì)菌基因突變率增高、抗菌藥物研制相對滯后等原因，多重耐藥菌感染患者越來越多，且有一定可能在區(qū)域范圍內(nèi)流行，危害人類的健康。對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的用藥，臨床上多以經(jīng)驗(yàn)療法為第一方案；而對患者腦脊液或痰進(jìn)行培養(yǎng)通常耗時(shí)長，且特異性低，難以在疾病早期制訂個(gè)體化治療方案；因此芯片技術(shù)在耐藥性的檢測以及指導(dǎo)個(gè)體化用藥中具有重要的意義。

在基因芯片的研究中，早在1998年Gingeras 等[17]創(chuàng)造了針對RNA聚合酶β亞基基因而設(shè)計(jì)的基因芯片，在實(shí)現(xiàn)快速檢測結(jié)核分枝桿菌的同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對利福平的耐藥性與該基因相關(guān)。2001年Mikhai lovich V等[18]針對該亞基基因并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)化，制備出含更多寡核苷酸的芯片，其可以在短時(shí)間內(nèi)識別該基因的多個(gè)突變位點(diǎn)，更全面研究該基因?qū)е碌哪退幮?。Yu G等[19]挑選出包括10種已知的耐藥基因在內(nèi)的92個(gè)基因作為候選基因，并制作出基因微陣列，通過藥物敏感性測試，表明這些耐藥基因表達(dá)水平和耐藥程度之間的極強(qiáng)的相關(guān)性；這些發(fā)現(xiàn)能在耐藥機(jī)制的研究中提供更多的理論依據(jù)。Perreten等[20]人早在2005年就建立起了革蘭氏陽性菌的抗生素耐藥性的基因檢測寡核苷酸芯片。Strauss C團(tuán)隊(duì)在2015年更是建立了一種基于芯片技術(shù)的新穎的DNA標(biāo)記與擴(kuò)增系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以同時(shí)檢測117種革蘭氏陽性菌耐藥基因，并且針對某一細(xì)菌，其可以檢測出細(xì)菌內(nèi)的多個(gè)基因，如金黃色葡萄球菌菌株BM3318，檢測到的基因多達(dá)15個(gè)，其特異性達(dá)到95%[21]。

在液相芯片的研究中，周林甫[22]依據(jù)katG、inhA和rpoB等結(jié)核相關(guān)耐藥基因，合成8段含不同檢測位點(diǎn)及不同基因型的序列，與微球雜交后經(jīng)液相芯片檢測，結(jié)果顯示該方法在檢測不同位點(diǎn)、相同位點(diǎn)不同基因型等情況時(shí)均具有較高的特異性。最后作者收集了153例臨床樣本，用液相芯片法檢測4個(gè)目的位點(diǎn)的11種基因型，并與基因測序法進(jìn)行比較，結(jié)果示液相芯片法能夠快速有效地檢測出各位點(diǎn)的基因型，與基因測序結(jié)果基本一致。Lee等[23]對357例臨床結(jié)核患者的DNA和結(jié)核分枝桿菌H37RV株通過多重PCR擴(kuò)增，隨后使用等位基因特異性引物延伸技術(shù)得到了23對引物。該產(chǎn)品最終使用懸液芯片微陣列檢測，并將結(jié)果與基因測序的的結(jié)果進(jìn)行比較，得出該芯片技術(shù)在檢測異煙肼耐藥基因的敏感性和特異性分別是83%和97%，利福平的分別是90%和100%，乙胺丁醇的分別是58%和86%，且該技術(shù)具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。

3 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)致病機(jī)制的應(yīng)用

目前幾乎所有疾病發(fā)生和發(fā)展都是與基因或蛋白質(zhì)功能及相互作用變化有關(guān)，生物芯片技術(shù)可以整體監(jiān)測和分析病原體及其感染宿主的成千上萬個(gè)基因及其表達(dá)水平，由此可研究病原體入侵宿主后在疾病的不同發(fā)展階段的基因表達(dá)情況及其防御、逃避、轉(zhuǎn)移機(jī)制，同時(shí)可以評價(jià)宿主免疫功能；生物芯片技術(shù)還可以通過對比宿主內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)病原菌基因表達(dá)情況以及同種病原的不同基因型別在宿主體內(nèi)的基因表達(dá)情況，分析并篩選出可能的致病基因。

在基因芯片的研究中，Laassri等[24]通過對感染登革病毒和西尼羅河病毒患者的腦脊液及血液使用基因芯片技術(shù)分析，揭示了一些自發(fā)的現(xiàn)象導(dǎo)致核酸改變，這些位點(diǎn)常位于包膜蛋白(E)和非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A,NS4B,NS5。趙雁林等[25]通過使用基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)方法對63例結(jié)核患者與69例肺癌患者的癌性胸腔積液和其外周血中單核細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析比較,篩選出了53個(gè)差異性表達(dá)基因，為結(jié)核對宿主免疫功能的影響研究提供了理論依據(jù)，同時(shí)為結(jié)核性腦膜炎的相關(guān)研究打下了基礎(chǔ)。Xu等[26]使用人類全基因組微陣列用于分析感染腸病毒71型的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。結(jié)果表明，EV71感染導(dǎo)致161個(gè)細(xì)胞的mRNAs表達(dá)發(fā)生改變，包括74個(gè)上調(diào)的基因和87個(gè)下調(diào)的基因。生物信息學(xué)分析表明，差異表達(dá)的mRNA的可能在細(xì)胞的增殖，凋亡以及細(xì)胞因子、趨化因子應(yīng)答中起作用，并且該微陣列的結(jié)果與傳統(tǒng)的realtime RT-PCR的結(jié)果有高度的一致性。這一發(fā)現(xiàn)將有助于解釋EV71感染和病毒宿主的發(fā)病機(jī)制相互作用。

在蛋白芯片的研究中，Li R等[27]人使用蛋白質(zhì)微陣列研究皰疹病毒的絲氨酸/蘇氨酸激酶，并證明其對皰疹病毒在人類細(xì)胞中的復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用；隨后他們利用人類蛋白質(zhì)組芯片從單純皰疹病毒，人類巨細(xì)胞病毒，EB病毒，和卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒中確定了病毒共同的激酶基質(zhì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA損傷應(yīng)答途徑的上游調(diào)控因子乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP60在皰疹病毒復(fù)制中必不可少，這一發(fā)現(xiàn)為抗皰疹病毒藥物的研發(fā)提供幫助。

在液相芯片的研究中，Beran等[28]針對腦膜炎球菌疾病患者CSF和血中的促炎細(xì)胞因子，設(shè)計(jì)了一種高通量的液相芯片，通過檢測促炎細(xì)胞因子的變化從而來反映疾病的嚴(yán)重程度。van Heteren等[29]通過使用luminex系統(tǒng)，對病毒性腦炎、AGS和不名原因的發(fā)熱患者腦脊液和血清中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測和分析，從而證實(shí)了干擾素-α和趨化因子10抗體在AGS綜合征的發(fā)病機(jī)制中的作用。Ye N等[30]通過使用Luminex技術(shù)，把感染腸道病毒71型的患者與健康兒童的血漿和腦脊液中的細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)了在較危重病人中，血漿中的IL-1β，IL-6，IL-10，和IL-8較高；腦脊液IL-6，IL-8，和IP-10的水平較高，而RANTES較低；并且恢復(fù)期腦脊液中細(xì)胞因子的水平較治療期低；通過對細(xì)胞因子變化情況的分析，可以為感染患者的治療提供幫助。Durrant DM等[31]使用CCR5受體缺陷小鼠并建立了一個(gè)西尼羅河病毒性腦炎的模型，通過液相芯片技術(shù)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域趨化因子的表達(dá)進(jìn)行分析，揭示了CCR5配體，CCL4和CCL5表達(dá)的重要性，并驗(yàn)證了CCR5在大腦區(qū)域內(nèi)限制病毒復(fù)制的作用。

4 不足與展望

由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病種類繁多，且有著較高的致殘率和致死率，隨著近年來細(xì)菌、病毒耐藥性的增加以及新型病毒不斷出現(xiàn)，而傳統(tǒng)的檢測方法有著通量低、操作繁瑣、耗時(shí)長等明顯劣勢，目前急需一種高通量、高效率、高精確度的技術(shù)去及時(shí)準(zhǔn)確的診斷此類疾病，因此生物芯片技術(shù)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中的研究中取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，并且在科研以及臨床實(shí)踐過程中不斷完善，但目前該技術(shù)仍有許多不足，如在基因芯片檢測中，目標(biāo)基因和探針雜交易發(fā)生錯(cuò)配，漏配，需要進(jìn)一步提高其特異性；在對mRNA表達(dá)情況的進(jìn)行檢測時(shí)，由于編碼蛋白的表達(dá)往往需要進(jìn)行基因的乙?；?、甲基化修飾，修飾后基因檢測的準(zhǔn)確性有待提高。在懸液芯片和蛋白芯片的檢測中，待檢樣品的成分復(fù)雜多變，各個(gè)生物分子之間的相互作用、抗原或抗體與芯片或微球非特異結(jié)合等均可導(dǎo)致檢測結(jié)果的特異性降低，同時(shí)成千上萬蛋白質(zhì)的純化以及生物學(xué)活性的保持也是具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)[32]；生物芯片目前在國內(nèi)價(jià)格較高，實(shí)驗(yàn)流程較多，且操作標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)分析標(biāo)準(zhǔn)均未達(dá)成一致的意見；絕大多數(shù)科研人員僅僅是大量重復(fù)國外的研究，創(chuàng)新性的缺乏及生物芯片的高端核心技術(shù)缺少也是制約著我國芯片技術(shù)發(fā)展的重要原因。隨著更多專業(yè)人員的共同努力，該技術(shù)將在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相關(guān)領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

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10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.05.026

2016-04-22；

2016-07-29

南華大學(xué)附屬郴州醫(yī)院院內(nèi)基金(編號：2013—001).

*通訊作者，黃仁彬，E-mail:985539337@qq.com.

R741

A

蔣湘蓮)

知識介紹

臨床試驗(yàn)中的隨機(jī)化分組

隨機(jī)化分組就是將參加臨床試驗(yàn)的受試者隨機(jī)分配到試驗(yàn)組和對照組的方法。這樣做的目的可以保證每一個(gè)受試者均有相同的機(jī)會被分配到試驗(yàn)組或?qū)φ战M，并且保證一些可能影響試驗(yàn)結(jié)果的臨床特征和干擾因素在兩組之間分配均衡，使兩組具有可比性。在進(jìn)行隨機(jī)化分組時(shí)，應(yīng)遵循的原則為所有的干預(yù)方案和評估方法這時(shí)應(yīng)已確定而不能再改變，研究者中的直接處理人員和受試者不能參與分配，臨近處理實(shí)施之時(shí)才能揭曉分組結(jié)果，一旦分組結(jié)果公布，受試者不能再交換組別。隨機(jī)化分組有下述幾種方法：

(1)完全隨機(jī)化分組：先將受試者編號，再用抽簽或隨機(jī)數(shù)字表的方法分組。這種情況適合于一些主要干擾因素在受試者之間的分布比較均勻的樣本人群。

(2)區(qū)段隨機(jī)化分組：根據(jù)受試者進(jìn)入臨床試驗(yàn)的時(shí)序分為若十個(gè)區(qū)段，再對每個(gè)區(qū)段隨機(jī)化分組。這種設(shè)計(jì)比較適合臨床特點(diǎn)，根據(jù)患者陸續(xù)就醫(yī)的情況，將患者按就醫(yī)先后分成不同區(qū)段，然后在每組隨機(jī)分配，可提高研究效率。

(3)分層隨機(jī)化分組：先根據(jù)干擾因素或受試者的臨床特征分層，然后再在每層隨機(jī)化分組。這種情況適合于受試者之間干擾因素分布不均衡時(shí)，可以消除干擾因素對預(yù)后的影響。

在臨床實(shí)踐中，患者往往是陸續(xù)就醫(yī)的，研究者不可能待患者都集中后再分組進(jìn)行治療試驗(yàn)，所以，應(yīng)在研究開始前即按就醫(yī)的順序號將患者分組，一旦患者就醫(yī)并符合入選條件時(shí)，就可將患者隨機(jī)地分配到試驗(yàn)組或?qū)φ战M。

中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志編輯部