無創(chuàng)DNA陽性結(jié)果的驗證和分析

燕鳳　陳必良　徐慧　李春燕　徐盈　王德堂　郭芬芬　黎昱　鄭嬌　張建芳

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前會診中心，陜西 西安　710032)

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無創(chuàng)DNA陽性結(jié)果的驗證和分析

燕鳳陳必良徐慧李春燕徐盈王德堂郭芬芬黎昱鄭嬌張建芳

(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前會診中心，陜西 西安710032)

目的探討無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用及價值。方法對2012年1月至2014年12月在西京醫(yī)院婦產(chǎn)科做羊水穿刺的病人資料回顧性分析，發(fā)現(xiàn)因無創(chuàng)陽性做羊水穿刺的孕婦84例，用羊水染色體核型分析和FISH對其結(jié)果進行驗證，并對兩者不一致的結(jié)果進行電話隨訪。結(jié)果無創(chuàng)DNA84例陽性結(jié)果中21-三體48例，經(jīng)羊水穿刺后確認為假陽性的有2例；18-三體11例，經(jīng)羊水穿刺后確認為假陽性3例；13-三體4例，經(jīng)羊水穿刺驗證2例為假陽性；性染色體異常21例，經(jīng)驗證6例假陽性。結(jié)論孕婦外周血中游離胎兒DNA檢測對21-三體檢測準確率達95.8%，18-三體準確率73%，性染色體檢出準確率71%，13-三體準確率50%。無創(chuàng)DNA是產(chǎn)前篩查21-三體的有效方法，對其他染色體異常的檢測還需要進一步提高現(xiàn)有檢測技術(shù)。

無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測； 異常結(jié)果； 核型分析；FISH

染色體非整倍體是指相對于人正常的46條染色體細胞中的一條或幾條染色體數(shù)目增加或減少。目前，我國新生兒中染色體的發(fā)病率為1/60，其中21-三體、18-三體和13-三體是3種最主要的染色體非整倍體疾病。目前臨床上對胎兒這幾種病變產(chǎn)前診斷方法主要是通過B超引導(dǎo)下的羊水穿刺染色體核型分析，該技術(shù)檢測所需時間長，穿刺過程又對胎兒有一定的風(fēng)險。因此，尋求安全、準確、快速的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)是優(yōu)生優(yōu)育的基本需要。而胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測通過采取孕婦靜脈血，利用新一代DNA測序技術(shù)對母體外周血漿中的游離DNA 片段(包含胎兒游離DNA)進行測序，并將測序結(jié)果進行生物信息分析，可以從中得到胎兒的遺傳信息[1]。本研究利用高通量測序技術(shù)檢測孕婦外周血中的游離DNA，對其異常結(jié)果進行分析驗證，旨在探討無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測的臨床應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1.1基本資料2012年1月至2014年12月在西京醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心因無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測結(jié)果高風(fēng)險的孕婦84例，自愿做羊水穿刺。使用染色體FISH和核型分析對無創(chuàng)結(jié)果進行驗證并對每個孕婦的妊娠結(jié)局的進行隨訪。

1.2方法

1.2.1染色體制備B超引導(dǎo)定位，在無菌條件下，采用羊水專用穿刺針經(jīng)腹部穿刺，抽取15 ml 羊水，經(jīng)離心處理后接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為CHANG MEDIUM。經(jīng)過換液后觀察，鏡下見小堆貼壁細胞長成大的克隆，并出現(xiàn)成對圓形透亮細胞，即可加入秋水仙堿收獲細胞，經(jīng)低滲、數(shù)次固定后常規(guī)制片，60～80℃烤片2小時。G顯帶染色分析。

1.2.2FISH檢測未培養(yǎng)的羊水參照金菩嘉公司提供的操作步驟處理后進行FISH分析。每個雜交區(qū)至少數(shù)100個信號強、無重疊的雜交細胞。CSP18/X/Y探針和GLP13/21探針。陽性判斷標準：GLP13/21、CSP18/X/Y探針至少計數(shù)100個細胞，非整倍體細胞比例>60%判為非整倍體。非整倍體細胞比例>30%為嵌合體。

1.2.3追蹤隨訪對因無創(chuàng)陽性做羊水穿刺確診的孕婦進行電話隨訪，隨訪其妊娠結(jié)局或出生后孩子的性別及出生后的健康狀況。

2　結(jié)果

無創(chuàng)DNA84例陽性結(jié)果中，21-三體48例，18-三體11例，13-三體4例，性染色體異常21例。無創(chuàng)84例陽性結(jié)果無創(chuàng)提示48例21-三體經(jīng)羊水染色體核型和FISH驗證16例為21-三體，2例假陽性，假陽性率為4.2%。無創(chuàng)DNA檢出18-三體11例經(jīng)驗證，3例假陽性，假陽性率為27%；無創(chuàng)13-三體高風(fēng)險有4例經(jīng)驗證2例為假陽性，假陽性率為50%；無創(chuàng)DNA提示性染色體異常21例，經(jīng)核型和FISH驗證6例為假陽性，假陽性率為29%。

84例無創(chuàng)DNA結(jié)果異常的孕婦均對其進行了電話隨訪，其中染色體異常結(jié)果共71例引產(chǎn)70例，其中1例胎兒核型47,XXY，孕婦不想引產(chǎn)。因孕婦已發(fā)生3次胚胎停育此次自愿繼續(xù)妊娠。其中13例無創(chuàng)DNA假陽性結(jié)果經(jīng)染色體核型和FISH確認染色體核型正常的出生后電話隨訪后，家屬均口述發(fā)育正常，健康，隨訪發(fā)現(xiàn)性別與染色體結(jié)果均一致。

3　討論

在孕婦妊娠期開辟一種安全、可靠的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷方法進行產(chǎn)前干預(yù)，是當(dāng)前降低出生缺陷率最切實可行的方法。目前侵入式取樣是產(chǎn)前診斷的金標準，但其存在一定的弊端[2]。因此針對妊娠高危人群進行多技術(shù)聯(lián)合篩查和診斷，并根據(jù)病人自身情況作出合適的選擇。胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測技術(shù)它具有無創(chuàng)性、孕早期檢測、相對血清學(xué)檢查有很高的準確性。早孕期檢測最主要的優(yōu)勢是早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，早期終止妊娠相對于中期引產(chǎn)更安全，還可以減少孕婦及家屬的焦慮。但胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測技術(shù)也有一定的局限性。首先該技術(shù)對目前檢測的對象具有局限性，如母體本身染色體有異常( 如嵌合體， 21-三體平衡易位攜帶)，或者母體在孕前期接受異體輸血、移植手術(shù)、干細胞治療等，均對檢測結(jié)果的準確性造成影響。并且孕婦孕周較大接受胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測，檢測的結(jié)果為陽性的，再接受羊水穿刺手術(shù)檢查胎兒染色體，不僅增加病人的焦慮感，而且手術(shù)的風(fēng)險也相對增加。因此不建議孕周超過24周的孕婦做無創(chuàng)基因檢測。同時對于B超篩查如心腦血管系統(tǒng)異常，羊水量異常，明顯器官、四肢異常及NT值異常的都不建議做無創(chuàng)基因檢測。同時，雙胎或多胎也不適合做無創(chuàng)基因檢測。

影響無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果準確性的主要因素是孕婦外周血中胎兒游離DNA濃度。如果胎兒游離DNA濃度低于3%，檢測結(jié)果的準確性將受到一定的影響[3,4]。研究表明，孕婦血清中游離DNA的含量受孕周和體重的影響。一般認為孕8周后孕婦外周血中游離胎兒DNA含量上升并穩(wěn)定存在，孕期胎兒DNA含量在5%～50%，孕周越大DNA含量越高。無創(chuàng)DNA要求孕婦血清中游離DNA的含量占外周血中總DNA的50%以上，所以當(dāng)孕婦由于各種原因?qū)е伦陨碛坞xDNA含量增高時孕婦血中胎兒游離DNA含量就相對偏低，這時就會導(dǎo)致檢測失敗。臨床上引起孕婦自身DNA增高的原因有溶血、腫瘤等，另外也可能與個體差異有關(guān)。如孕婦自身體重指數(shù)肥胖，將增加循環(huán)血量而導(dǎo)致的稀釋作用，使孕婦血液中胎兒游離DNA濃度降低[5]；孕婦自身游離DNA總量隨體重指數(shù)按比例增加，而胎兒游離DNA不增加，即相當(dāng)于胎兒游離DNA濃度降低[6]。

目前無創(chuàng)DNA技術(shù)被傾向于定位為T21、T18和T13等常見染色體非整倍體的篩查手段，受檢者需要在給予充分咨詢、知情同意的情況下自愿選擇參加無創(chuàng)DNA檢測。

對于本次研究無創(chuàng)結(jié)果與傳統(tǒng)胎兒染色體方法進行分析發(fā)現(xiàn)，其中21-三體的準確率最高，其次為18-三體和性染色體，13-三體的準確率相對較差。研究發(fā)現(xiàn)18-三體、性染色體檢測穩(wěn)定性較差，受GC含量干擾所致[7]，Jiang F等[8]以標準Z-Score值為基礎(chǔ)，通過改進染色體內(nèi)標參照及計算方式，實現(xiàn)結(jié)果值變異系數(shù)小，一定程度上克服GC含量問題，提高和穩(wěn)定了18-三體及性染色體檢出率，而后繼研究需要我們不斷克服技術(shù)難題，并逐步推向臨床。綜上所述，胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測技術(shù)對于診斷 21-三體綜合征敏感性及特異性高，且因其為無創(chuàng)診斷，能有效緩解孕婦及家屬的心理負擔(dān)，故該檢測方法可應(yīng)用于唐氏綜合癥的早期產(chǎn)前診斷的新技術(shù)。

本次實驗采用羊水核型分析和FISH技術(shù)對無創(chuàng)DNA進行驗證，核型和FISH的符合率為99%，只有1例結(jié)果不一致，F(xiàn)ISH結(jié)果為45,XO(35%)/ 46,XX，而核型結(jié)果為45,XO究其原因，這是因非整倍體細胞傳代培養(yǎng)時較正常細胞生長速度快，原有的正常細胞比例就會在傳代被稀釋，如分子技術(shù)很易檢測的45,XO/46,XX嵌合，經(jīng)細胞培養(yǎng)后的核型分析為單純45,XO。抽臍血驗證后以FISH結(jié)果為準。FISH技術(shù)作為一個新的生物學(xué)診斷技術(shù)，可以對流產(chǎn)組織及產(chǎn)前診斷標本進行目標染色體數(shù)目異常的檢測。本研究中通過和常規(guī)細胞遺傳學(xué)方法的對比，F(xiàn)ISH技術(shù)顯現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢：①檢測周期短，可以48～72小時出結(jié)果；②檢測成功率高，本研究中成功率達到了100%；③取材時間不受孕周限制；④檢測標本不受限；⑤操作簡便；⑥FISH技術(shù)是低嵌合體檢出判斷的金標準。但是FISH技術(shù)也有一定的局限性，只能檢測目標染色體數(shù)目異常，對染色體結(jié)構(gòu)異常不能檢測。因此FISH技術(shù)作為獨立的產(chǎn)前診斷技術(shù)是有一定風(fēng)險的。

因此對于國內(nèi)目前的技術(shù)現(xiàn)狀，做好孕婦產(chǎn)前診斷遺傳咨詢工作至關(guān)重要，根據(jù)孕婦的不同臨床情況做出不同的檢查項目。由于無創(chuàng)DNA 檢測技術(shù)的一些局限性[9,10]，所以，目前的胎兒染色體診斷以細胞遺傳學(xué)和FISH為主，無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)和基因芯片等技術(shù)可以對傳統(tǒng)方法進行有益的補充，多種檢測方法聯(lián)合應(yīng)用，以提高產(chǎn)前診斷的準確性、成功率。目前出現(xiàn)如此多的快速產(chǎn)前診斷技術(shù)，目的是促進優(yōu)生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，而不應(yīng)成為臨床專業(yè)人員的障礙當(dāng)然也提出了更高的要求，如何選擇應(yīng)用這些技術(shù)，如何達到最優(yōu)的質(zhì)量控制，如何做到檢測前后最充分的咨詢等。

[1]邊旭明.胎兒染色體非整倍體的無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測[J].實用婦產(chǎn)科雜志,2013,29(5)：330-333.

[2]楊燦鋒，石錦平，肖建平,等.無創(chuàng)DNA測序與傳統(tǒng)方法在產(chǎn)前診斷應(yīng)用中的比較[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22(11):27-28.

[3]Palomaki GE，Kloza EM，Lambert-Messerlian GM,et al.DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: An international clinical validation study[J].GenetMed,2011,13(11):913-920.

[4]Palomaki GE,Deciu C,Kloza EM,et al.DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an internationalcollaborativestudy[J].Genet Med,2012,14(3):296-305.

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編輯：宋文穎

ObjectiveTo investigate the clinical application value of non-invasive gene detection of aneuploidy in fetal as noninvasive prenatal diagnosis． MethodThe amniocentesis and karyotyping results in Xijing Hospital from January 2012 to December 2014 were retrospectively analyzed.The only indication for amniocentesis in these group of woman was positive NIPS (Non-invasive prenatal screening) results.84 case of positive NIPS results were required for validating by fetal karyotype analyzing through invasive procedures such as amniotic cavity.The NIPT result were compared with the fetal karyotyping and FISH for verification and analysis，telephone follow up after fetus birth for the chromosome result .ResultsAbnormal 84 cases did amniotic fluid puncture or umbilical cord puncture and chromosome karyotype analysis,48 cases of trisomy 21 were detected that 2 cases were false positive,11 cases of trisomy 18 were detected that 4 cases were false positive，4 cases trisomy 13 were detected that 2 cases were false positive，21cases abnormal in sex chromosome were detected that 6 cases were false positive.ConclusionsSequencing technology of free fetal DNA in pregnant women，detection of trisomy 21、trisomy 18 、trisomy 13 and abnormal in sex chromosome accuracy up to 95.8%,73%,71%and 50%.Non-invasive detection of DNA was an effective method of prenatal screening of trisomy 21，but on trisomy 18、13 trisomy and sex chromosome detection rate、accuracy rate to be further improved existing technologies.

noninvasive DNA prenatal testing；abnormal test results；karyotype analysis；FISH

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.02.005

陜程(L03-09)

張建芳，E-mail：zhzhhao@163.com

R714.53

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2016-03-24)