生長(zhǎng)受限胎兒染色體微陣列結(jié)果分析

朱輝　林少賓　黃林環(huán)　何志明　黃軒　周祎　方群　羅艷敏

(廣州市中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科胎兒醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州　510080)

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生長(zhǎng)受限胎兒染色體微陣列結(jié)果分析

朱輝林少賓黃林環(huán)何志明黃軒周祎方群羅艷敏

(廣州市中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科胎兒醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州510080)

目的探討染色體微陣列分析(CMA)技術(shù)在胎兒生長(zhǎng)受限(FGR)中的應(yīng)用價(jià)值。方法選取2013年3月至2015年5月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)中心以FGR為指征行產(chǎn)前診斷的95份病例進(jìn)行回顧性分析，所有病例行傳統(tǒng)染色體核型分析，68例行CMA檢測(cè)。結(jié)果核型分析檢測(cè)出8.42%(8/95)的異常，而CMA發(fā)現(xiàn)14.71%(10/68)的異常。在核型正常的FGR中，CMA額外檢出8.33%的異常。CMA檢測(cè)的異常包括2號(hào)染色體單親二體和5q12.1、19p13.3p13.2和11p14.3等染色體微缺失/微重復(fù)。相關(guān)基因包括PMP22、ERCC8和C3。結(jié)論CMA技術(shù)可以顯著提高FGR遺傳學(xué)病因的檢出率。

胎兒生長(zhǎng)受限；染色體微陣列分析技術(shù)；染色體核型分析

胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)指胎兒受各種不利因素影響，未能達(dá)到其潛在所應(yīng)有的生長(zhǎng)速率。FGR是圍生期的重要并發(fā)癥，其圍生兒死亡率為正常胎兒的4～6倍，居圍生兒死亡原因第二位[1]。FGR的發(fā)生率約5%～10%[2]。影響FGR的病因復(fù)雜，其中遺傳因素所占的比例約為30%～70%，約40%尚不明確[3，4]。染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)技術(shù)可以在全基因組范圍內(nèi)檢測(cè)染色體不平衡的拷貝數(shù)變異(copy number variant，CNV)，能高分辨檢測(cè)染色體的微缺失和微重復(fù)。與染色體核型分析和熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)相比，CMA技術(shù)具有高通量、高分辨率和高自動(dòng)化檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已經(jīng)應(yīng)用于侵入性產(chǎn)前診斷。本文對(duì)2013年3月至2015年5月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)中心以FGR為指征行產(chǎn)前診斷的95份病例進(jìn)行回顧性分析，旨在探討CMA在FGR的產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象回顧性分析2013年3月至2015年5月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胎兒醫(yī)學(xué)中心產(chǎn)前診斷為FGR的95例臨床資料。根據(jù)末次月經(jīng)及孕早期B超檢查核實(shí)孕周無(wú)誤。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)FGR的診斷標(biāo)準(zhǔn)為胎兒體重低于同孕齡胎兒平均體重第十百分位數(shù)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)本的采集所有參與研究的對(duì)象均接受檢測(cè)前的遺傳咨詢(xún)并簽署知情同意書(shū)。依據(jù)孕周大小進(jìn)行羊膜腔穿刺(16～24周)和臍靜脈穿刺(>24周)。在B超腹部探頭引導(dǎo)下分別行羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水30ml或臍靜脈穿刺抽取臍血3ml進(jìn)行培養(yǎng)以及染色體核型分析或CMA。

1.3.2染色體核型分析對(duì)取得的胎兒羊水或臍血標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、制片、G顯帶，顯微鏡下檢查20個(gè)核型，分析3個(gè)核型，若出現(xiàn)嵌合體則檢查50個(gè)或100個(gè)核型。

1.3.3CMA檢測(cè)采用美國(guó)Affymetric公司提供的高分辨率全基因組CytoScan HD芯片。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照Affymetric公司提供的操作流程。該芯片不僅能檢測(cè)基因組缺失、重復(fù)，還能檢測(cè)雜合性缺失和單親二體。

1.3.4CNV的判斷和評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)分析過(guò)程分別參照本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)以及在線(xiàn)公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，如DGV數(shù)據(jù)庫(kù)、DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)等。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 20.0軟件計(jì)算95%的可信度區(qū)間(confidence intervals，CI)和統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1臨床資料特點(diǎn)孕婦平均年齡(28±4)歲(19～38歲)，初產(chǎn)婦71例，經(jīng)產(chǎn)婦24例。在中孕期產(chǎn)前診斷為FGR 50例，在晚孕期產(chǎn)前診斷為FGR 45例。孕婦初次診斷FGR的平均孕周(27±4)周(18～35周)，行介入性產(chǎn)前診斷的平均孕周為(29±4)周(20～36周)。妊娠結(jié)局中足月分娩31例，早產(chǎn)13例，引產(chǎn)36例，失訪(fǎng)15例。

2.2核型分析與CMA檢測(cè)結(jié)果的比較95例FGR均行核型分析檢測(cè)，68例行CMA檢測(cè)。傳統(tǒng)染色體核型分析在8.42%(8/95)的病例中檢出異常(95%CI，2.84%～14.01%)，CMA發(fā)現(xiàn)14.71%(10/68)的異常(95%CI，6.29%～23.12%)。

2.3核型正常FGR的CMA檢測(cè)結(jié)果在核型正常的FGR中，有60例行CMA檢測(cè)， CMA檢出5例異常(8.33%；95%CI，1.34%～15.33%)。涉及的染色體片段包括17p12區(qū)域1.364Mb的微重復(fù)、2號(hào)染色體的單親二體、5q12.1區(qū)域307kb的微缺失、19p13.3p13.2區(qū)域1.153Mb的微缺失和11p14.3區(qū)域1.357Mb的微缺失。

3　討論

3.1核型分析與CMA技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)的比較染色體核型分析作為傳統(tǒng)的檢測(cè)染色體異常的方法，已應(yīng)用于產(chǎn)前診斷多年，可在全基因組檢測(cè)染色體數(shù)目或大的結(jié)構(gòu)異常。但傳統(tǒng)核型分析技術(shù)耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)要求較高，分辨率低(難以檢出小于5Mb的染色體異常)，自動(dòng)化分析程度低，主觀性較強(qiáng)，無(wú)法對(duì)FGR中染色體亞顯微結(jié)構(gòu)變異——染色體微重復(fù)、微缺失進(jìn)行檢測(cè)。

CMA較核型分析技術(shù)而言，具有快速、簡(jiǎn)便、高通量、高自動(dòng)化、客觀性好，能夠檢測(cè)染色體亞顯微結(jié)構(gòu)的改變。在2012年，Wapner[5]在研究了行絨毛活檢或者羊膜腔穿刺4406例的臨床資料的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)CMA在胎兒結(jié)構(gòu)異常中的檢出率為6%。在一橫斷面研究中，Lee CN[6]分析了2497例產(chǎn)前超聲提示異常但核型正常的樣本，結(jié)果表明CMA在單發(fā)畸形中可檢出10.5%的有臨床意義的異常，在多發(fā)畸形中，其檢出率可達(dá)到15.4%。與之類(lèi)似，Gruchy N等[7]對(duì)38例FGR或/合并胎兒多發(fā)畸形的孕婦行CMA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在染色體核型分析正常的情況下，CMA能檢出8%有意義的染色體異常。本研究的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了FGR的遺傳學(xué)病因除了與染色體結(jié)構(gòu)異?；蚍钦扼w有關(guān)，還與染色體微缺失/微重復(fù)有關(guān)。

3.2CMA檢測(cè)結(jié)果分析本研究中，CMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)17p12區(qū)域存在大小約為1.364Mb的微重復(fù)(重復(fù)區(qū)域含PMP22基因)和2p25.3q37.3區(qū)域存在父源性單親二體(UPD 2)。PMP22串聯(lián)重復(fù)可致進(jìn)行性腓骨肌萎縮癥1型 (Charcot-Marie-Tooth syndrome type 1A，CMT1A)[8]。目前暫未發(fā)現(xiàn)CMT1A與胎兒生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)FGR是UPD2的常見(jiàn)臨床表型[9]，但其作用機(jī)制仍不清楚。

此外，CMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5q12.1區(qū)域大小約為307kb的微缺失。在這缺失片段中，包含致病基因切除修復(fù)交叉互補(bǔ)8基因(excision repair cross-complementing rodent repair deficiency，group 8，ERCC8)。一般認(rèn)為ERCC8是導(dǎo)致Cockayne綜合征A(Cockayne syndrome A，CSA)的致病基因。Cockayne綜合征是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳的神經(jīng)退行性病變，主要臨床表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、進(jìn)行性的神經(jīng)功能障礙、光敏性皮炎、特殊的鳥(niǎo)臉樣面容、惡病質(zhì)性侏儒癥外貌、先天性白內(nèi)障等[10，11]。ERCC8編碼的蛋白質(zhì)功能大多與核酸切除修復(fù)中的轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)通路有關(guān)。而在2014年，Sylvia Koch等[12]對(duì)ERCC8的功能有新的發(fā)現(xiàn)，ERCC8編碼的蛋白質(zhì)是RNA聚合酶I的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與CS蛋白TFIIH和CSB結(jié)合，促進(jìn)核糖體的生成，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的CSA大部分與ERCC8的復(fù)合雜合突變有關(guān)[13，14]，其缺失是否導(dǎo)致CSA的發(fā)生，尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，其基因缺失可能導(dǎo)致核糖體合成不足，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及FGR的出現(xiàn)的推測(cè)，也需進(jìn)一步的探討。

在19p13.3p13.2區(qū)域，CMA檢出大小約為1.153Mb的微缺失。該缺失區(qū)域包含OMIM基因C3。該基因編碼的蛋白質(zhì)是一種急性期反應(yīng)物，在補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中均發(fā)揮重要作用[15]。在一項(xiàng)動(dòng)物研究中，Wang-Ngai Chow等[16]發(fā)現(xiàn)敲除了C3基因的小鼠受孕率低，囊胚小，胎盤(pán)大小及重量均低于野生型。其作用機(jī)制有兩種可能：一是胎盤(pán)過(guò)小導(dǎo)致母胎之間的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸減少；二是缺乏C3的衍生物C3a。C3a又稱(chēng)為促?；鞍?acylation stimulating protein,ASP)，可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)甘油三酯的合成。C3a的缺乏可能導(dǎo)致脂肪代謝紊亂，從而影響胎兒大小。因此，我們推測(cè)本例FGR可能是由于C3的缺失，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂或營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，從而影響胎兒的發(fā)育，但仍需深入的研究來(lái)明確其作用機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了FGR的發(fā)生與染色體微缺失/微重復(fù)存在密切相關(guān)性。CMA技術(shù)不僅能夠檢測(cè)到傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)檢測(cè)不到的染色體微缺失/微重復(fù)，還能提示FGR候選致病基因，是尋找FGR遺傳病因的有效方法。

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編輯：宋文穎

ObjectiveTo evaluate the contribution of chromosomal microarray analysis (CMA) in the prenatal diagnosis of fetal growth restriction (FGR).MethodNinety-five FGR cases between March 2013 to May 2015 were retrospectively analyzed.All of cases were evaluated by traditional karyotype while 68 cases were evaluated by CMA.ResultsChromosomal aberrations were detected in 8.42% of the cases (8/95) by karyotype analysis ,while in 14.71% of the cases (10/68) by CMA.In cases with normal karyotype,CMA identified significant abnormalities in 8.33% of FGR cases.The aberrations detected by CMA include uniparental disomy 2,microdeletions or microduplications of 5q12.1,19p13.3p13.2 and 11p14.3,containing PMP22,ERCC8 and C3 gene.ConclusionsCMA is an effective method for the genetic diagnosis of FGR.

fetal growth restriction；chromosomal microarray analysis；karyotype.

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.02.004

中山大學(xué)青年教師培育項(xiàng)目(13ykpy18)

羅艷敏 郵箱：luoyanm@mail.sysu.edu.cn

R714.53

A

2016-04-30)