核桃優(yōu)良無性系組培初代培養(yǎng)條件探索

羅在柒﹡，顏鳳霞，田 凡

（貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005）

核桃優(yōu)良無性系組培初代培養(yǎng)條件探索

羅在柒﹡，顏鳳霞，田 凡

（貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005）

主要對核桃優(yōu)良無性系初代培養(yǎng)外植體材料選擇、消毒方法和培養(yǎng)條件進行探索，結(jié)果表明，核桃組培最佳外植體采集為3—6月份的莖尖，消毒方法應(yīng)盡可能簡便、快速，培養(yǎng)條件需經(jīng)過低溫暗培養(yǎng)，試驗結(jié)果可為核桃良種組培開繁提供借鑒。

核桃；組織培養(yǎng)；外植體選擇；消毒方法；培養(yǎng)條件

植物組培技術(shù)是工廠化生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的現(xiàn)代生物技術(shù)，也是快速繁殖植物新品種最主要的方法。迄今為止，植物組培技術(shù)在植物離體快繁、無病毒苗木培育、遺傳育種及種質(zhì)資源保存等方面都取得了顯著成績。GaleMcGranahan等報道，核桃成年品種離體繁殖已獲成功，并已進行生產(chǎn)試驗[1]。樊靖等報道了以5個核桃品種 (株系)10年生植株的莖段為外植體進行的離體培養(yǎng)和植株再生研究[2]。在核桃種胚的離體培養(yǎng)方面國內(nèi)外學(xué)者也做了大量研究。優(yōu)良無性系核桃組培由于樹體本身富含多酚物質(zhì)，易發(fā)生褐化，初代培養(yǎng)難度大。本文主要進行核桃優(yōu)良無性系初代培養(yǎng)外植體材料選擇、消毒方法和培養(yǎng)條件的探索，以期對核桃無性系組培提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

核桃優(yōu)良無性系為黔林核1號（Juglans sigillata“qianlinhe-1”），1973年在牛棚初選，入選省級優(yōu)樹，1981—1990年進行無性系品比試驗，篩選為優(yōu)樹，1985年命名為早熟露仁核桃，作為大面積推廣的主栽品種。材料來源于貴州省林科院采穗圃。

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇

通過采集越冬頂芽和腋芽、萌動期頂芽和腋芽、快速生長期（半木質(zhì)化）頂芽和腋芽等材料，分不同批次消毒和接種，材料大小以莖段長度為計量標準，設(shè)置1～4cm，對比統(tǒng)計不同時期外植體材料以及材料的大小在核桃組培過程中褐化和生長情況。

1.2.2 消毒與抑制物質(zhì)篩選

消毒分為常規(guī)處理和新型消毒劑“山農(nóng)I號”作對比。常規(guī)處理用自來水沖洗材料30 min；用洗潔凈清洗材料，若大田材料污染較重，可以用軟毛刷輕輕刷洗莖段和葉片，然后用自來水沖洗干凈；用濾紙吸干其表面水分；置于2%硫代硫酸鈉溶液中浸泡20～30min；用蒸餾水沖洗4～5次。山農(nóng)I號，將外植體按要求枝剪后置于消毒液3min，直接接入培養(yǎng)基。抑制物質(zhì)以活性炭、PVP（聚乙烯吡咯烷酮Polyvinyl pyrrolidone）等做對比試驗，即每升培養(yǎng)基中添加1.5g活性炭和3.0gPVP，能有效抑制外植體褐化。

1.2.3 外植體培養(yǎng)

通過對照低溫暗培養(yǎng)、常溫暗培養(yǎng)和正常培養(yǎng)條件。正常培養(yǎng)條件白天溫度為25±3℃，夜間溫度為18±2℃，光照時間15h/d，光照強度2 000 lx，初代供試培養(yǎng)基均為改良DKW+BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體材料篩選，獲得脫毒有效外植體材料

不同時期采集外植體材料培養(yǎng)結(jié)果得到：越冬頂芽和腋芽雖然污染率高，但易于生長，黃化現(xiàn)象嚴重；萌動期頂芽和腋芽主要特點為褐化嚴重，外植體停止生長，其污染率低；快速生長期（半木質(zhì)化）頂芽褐化相對嚴重，污染率相對高，腋芽能較好萌發(fā)，但脫離母體后停滯生長。

通過外植體材料生物量大小試驗結(jié)果得到，核桃組培必須盡量增大外植體生物量，即外植體材料控制在4.0 cm左右，才能保證緩解外植體褐化，獲得有效脫菌無性系材料。

核桃組培最佳外植體為3—6月份的莖段，且莖段的芽較粗壯，約為0.3～0.5 cm，莖部木質(zhì)化程度不高的莖段萌芽率高。

2.2 外植體消毒方法的篩選

消毒方法的篩選主要是以控制外植體褐化，或者抑制啟動褐化物質(zhì)產(chǎn)生為原則，盡可能使消毒時間短、步驟少。通過試驗得到應(yīng)用過新型消毒劑，即“山農(nóng)I號”消毒液能較好實現(xiàn)消毒效果，比常規(guī)試劑如氯化汞、酒精等消毒效果更好。

2.3 抑制外植體褐化物質(zhì)的篩選

基本培養(yǎng)基篩選。通過試驗，在培養(yǎng)基中降低硝基鹽濃度，能緩解褐化發(fā)生，DKW培養(yǎng)基優(yōu)于MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中添加活性炭、PVP等物質(zhì)能有效緩解外植體褐化，即每升培養(yǎng)基中添加1.5 g活性炭和3.0 gPVP能有效抑制外植體褐化。 增加繼代頻次能使培養(yǎng)基多酚物質(zhì)與外植體分開，一定程度上減少對外植體的傷害。外植體接種后，3～5 d內(nèi)每天更換一次培養(yǎng)基，可以得到理想的效果。

2.4 培養(yǎng)條件的篩選

外植體接種后置于4℃冰箱暗培養(yǎng)3 d后，再繼續(xù)置于組培室中培養(yǎng)，有益于防治褐化的發(fā)生。尤其注意在拿出冰箱后第二天開始出現(xiàn)輕度的褐化現(xiàn)象，接著第3、4天，褐化會加劇且污染莖段亦呈現(xiàn)，需及時處理。在第15天左右，會出現(xiàn)萌芽現(xiàn)象。萌芽后再轉(zhuǎn)接培養(yǎng)很容易污染、長霉菌，特別是在長葉后更容易長菌污染且容易出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，所以每隔3～5 d需轉(zhuǎn)接一次。

3 結(jié)論

外植體應(yīng)選擇在3—6月核桃快速生長季的莖段，外植體材料盡可能粗壯，長度在4 cm左右為宜；消毒方法盡可能快捷，避免對外植體傷害，接種后經(jīng)4℃低溫暗培養(yǎng)3 d轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)。接種初期增加繼代次數(shù)更換培養(yǎng)基，有益于防治褐化的發(fā)生。

[1]McGranahanGH.etal.In vitro propagation of mature Persianwalnut cultivars[J].Hortsci. 1988,28(1):220.

[2]樊靖,劉慶忠,張俊林，等.核桃離體培養(yǎng)和

植株再生[J].2009,36(6):867-872.

1005-2690（2016）12-0104-02

S664.1

B

貴州省林業(yè)科研課題編號：黔林科合J字[2012]03號