上皮組織工程及其在耳鼻咽喉科的應(yīng)用研究△

張文瑾　孫建軍

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上皮組織工程及其在耳鼻咽喉科的應(yīng)用研究△

張文瑾＊孫建軍

上皮作為人體的組織器官，具有保護(hù)、吸收、分泌、排泄等功能。當(dāng)發(fā)生較大面積的上皮缺損時(shí)，通常需要上皮移植(自體或異體)來修復(fù)，但存在供區(qū)損傷或數(shù)量不足的問題。近年，應(yīng)用組織工程構(gòu)建上皮修復(fù)創(chuàng)面的研究取得了一定的進(jìn)展。本文綜述上皮組織工程所涉及的種子細(xì)胞、生物支架、細(xì)胞與支架的相互作用以及在耳鼻咽喉外科的應(yīng)用等相關(guān)問題。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：365-368)

上皮；組織工程；干細(xì)胞；支架材料；耳鼻咽喉科學(xué)

皮膚作為人體最大的組織器官，承擔(dān)維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，防止體液、電解質(zhì)丟失，阻止外界環(huán)境有害因素侵入體內(nèi)的功能。每年有數(shù)以百萬計(jì)的人承受著因火災(zāi)、高溫、化學(xué)物質(zhì)、紫外線、電磁輻射所致皮膚缺損的痛苦或疾病[1]。較大面積的皮膚缺損通常需要皮膚移植(自體或異體)來修復(fù)，但存在供區(qū)損傷或皮膚數(shù)量不足的問題。近年來使用組織工程皮膚修復(fù)創(chuàng)面取得了一定的療效。本文就上皮組織工程所涉及的種子細(xì)胞、生物支架、細(xì)胞與支架相互作用以及在耳鼻喉頭頸外科的應(yīng)用等相關(guān)問題進(jìn)行綜述。

1　相關(guān)種子細(xì)胞

迄今，皮膚組織工程研究人員已經(jīng)成功利用體細(xì)胞制備出皮膚類似物，例如Integra、 Apligraf等,它們已成為臨床修復(fù)應(yīng)用中非常重要的材料。但上述工程皮膚要求的新生兒包皮上皮細(xì)胞和包皮成纖維細(xì)胞不易獲取，在傳代培養(yǎng)中易老化等諸多問題仍難以解決。隨著干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，具有自我更新、無限增殖分裂、多向分化潛能的特殊細(xì)胞為解決上述問題帶來了希望。目前用于上皮組織工程的干細(xì)胞主要有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASCs)以及表皮干細(xì)胞。

Meruan等[2]在真皮替代物上培養(yǎng)ASCs，48 h后將復(fù)合物移植入大鼠皮膚缺損處，實(shí)驗(yàn)側(cè)比較對照側(cè)組織學(xué)顯示，ASCs顯著增加微血管密度和Ⅰ型膠原的合成。 Liu等[3]將BMSCs注射受傷的大鼠體內(nèi)，對照磷酸鹽緩沖液(PBS)組，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)表明， BMSCs在脂多糖(LPS)、白細(xì)胞介素1α(IL-1α)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的刺激下能夠表達(dá)轉(zhuǎn)化生長因子β-1、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、成纖維生長因子和肝細(xì)胞生長因子。

盡管BMSCs和ASCs在皮膚培養(yǎng)中顯示出巨大的優(yōu)勢，其自分泌的生長因子不僅促進(jìn)細(xì)胞的遷移和增殖[4]，同時(shí)促進(jìn)局部血管的生成，并且有在體外和體內(nèi)分化為表皮細(xì)胞的潛能，即形成皮膚類似物[5-7]；然而，它們可能需要經(jīng)過復(fù)雜的轉(zhuǎn)化才能成為目標(biāo)細(xì)胞。研究者通過化學(xué)因子誘導(dǎo)、基因修飾和蛋白質(zhì)修飾，從而調(diào)控信號分子誘導(dǎo)細(xì)胞分泌生物活性信號，使其分化為特定的上皮組織。Lu等[8]將包裝有基因硬脂酰輔酶A脫氫酶Ⅰ的病毒載體感染BMSCs，完成細(xì)胞培養(yǎng)和內(nèi)皮誘導(dǎo)，1周和2周后熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測定SCD1過度表達(dá)組中CD31、血管假性血友病因子和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的mRNA數(shù)量明顯高于空載體組和正常組，表明SCD1的高表達(dá)可能會(huì)提高誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。此外，Shokrgozar等[6]已觀察確定ASCs在角質(zhì)細(xì)胞生長因子的作用下可以分化為角質(zhì)細(xì)胞。

表皮干細(xì)胞或者是干細(xì)胞源性表皮有一定優(yōu)勢，它們在特定的環(huán)境中可以充分分化為表皮細(xì)胞，在較短的時(shí)間內(nèi)有高分化能力。預(yù)計(jì)在早期分化階段可能有助于皮膚高質(zhì)量的愈合和再生[9]?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，近年來表皮干細(xì)胞迅速成為研究熱點(diǎn)。Lough等[10]注射G蛋白偶聯(lián)受體6(G-protein coupled receptor 6，LGR6)+綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表皮干細(xì)胞到小鼠的傷口床，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組傷口愈合增強(qiáng)，新生卵泡生長，Wnt信號擴(kuò)大，血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子和血小板衍生生長因子增多，表明LGR6 +GFP表皮干細(xì)胞移植可以促進(jìn)上皮化、毛發(fā)生長和血管生成。

2　可行的支架材料

支架材料的作用在于為細(xì)胞提供增殖、分化的空間，同時(shí)重塑其外形?，F(xiàn)常用的支架材料主要分為化學(xué)合成的高分子可降解材料和天然可降解高分子材料。

2.1常用合成材料分為聚羥基乙酸、聚乳酸(聚L乳酸和聚D,L乳酸等)。其優(yōu)勢如下：①生物降解的可控性；②具有一定的機(jī)械張力；③無細(xì)胞毒性。但也有以下缺點(diǎn)：①親水性差；②降解緩慢,降解時(shí)間>2年[11]，且降解時(shí)產(chǎn)生CO2導(dǎo)致組織和細(xì)胞壞死[12]；③缺乏基底膜和天然的細(xì)胞識別位點(diǎn)[13]，從而缺乏生物活性。

2.2常用天然支架材料包括膠原、殼聚糖、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、透明質(zhì)酸、人脫細(xì)胞羊膜、瓊脂、角蛋白[12]等。其優(yōu)勢如下：①低的免疫原性；②良好的相容性；③富含活性物質(zhì)，如生長因子[14]。缺點(diǎn)：①有限的理化可控性；②很難改變降解率；③分離時(shí)難以純化。

為了克服上述材料的不足，更好地發(fā)揮它們的優(yōu)勢，主要通過改變支架表層界面的微觀結(jié)構(gòu)、組合材料增加親水性能等措施，模仿細(xì)胞外基質(zhì)的體系結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞在支架空間內(nèi)的黏附性，促進(jìn)其增殖、遷移和分化的能力。

Ravichandran等[15]比較了ASCs在TCP和2種納米纖維支架上的增殖情況。第14天和第21天，細(xì)胞在納米纖維組增殖明顯優(yōu)于TCP組。Babaeijandaghi等[16]制造出聚醚砜納米纖維，平均孔徑(492±106) nm，孔隙度為76.27%±1.24%，表面積為39 m2/g。成纖維細(xì)胞在聚苯乙烯和聚醚砜納米纖維支架上生存力沒有顯著差異，然而聚醚砜納米纖維較凡士林紗布可以有效加速傷口閉合，10 d后約90%的傷口閉合，12 d完全閉合。實(shí)驗(yàn)證明納米技術(shù)可以擴(kuò)大支架的表面積和孔隙率[12]，在增加氣體交換、改善膠原分布、加速表皮再生方面具有巨大潛能。廖玉珍等[17]將透明質(zhì)酸通過軟刻蝕的方法(the method of soft-lithography)在鈦金屬表面得到輪廓清晰的微米級小尺寸圖形，有效地將細(xì)胞限制在一定的區(qū)域，引導(dǎo)細(xì)胞朝一定的方向伸長，細(xì)胞骨架排列分布與細(xì)胞形態(tài)一致。

湯勇等[18]制備的膠原-殼聚糖膜既提高了單一膠原材料的拉伸強(qiáng)度和抗降解能力，又改善了單一殼聚糖材料的吸附力。通過對角蛋白、細(xì)胞膜波形蛋白、細(xì)胞核增殖抗原和培養(yǎng)上清液羥脯氨酸的測定，證實(shí)膠原-殼多糖適合鼓膜角朊細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長、增殖，并且成纖維細(xì)胞保持好的膠原分泌功能。Ravichandran等[15]也通過在聚乙烯醇中添加明膠來增加支架的親水性，從而增加細(xì)胞的黏附力。Nayak等[12]合成角蛋白/瓊脂支架，既彌補(bǔ)了瓊脂的低機(jī)械能，又提高了角蛋白的保水能力，同時(shí)證明C2C12細(xì)胞與支架具有很好的相容性。上述實(shí)驗(yàn)提示，親水性強(qiáng)的支架可以提高一些生長因子、細(xì)胞的吸附能力，促進(jìn)細(xì)胞的分泌能力。

3　細(xì)胞-支架相互作用

黏著斑黏附是細(xì)胞與材料接觸附著的主要形式，也是細(xì)胞與支架的特異性黏附方式。它們通過整合素和細(xì)胞-環(huán)境之間的介導(dǎo)信號連接細(xì)胞外基質(zhì)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架[19]。Kim等[19]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移速度在一定范圍內(nèi)隨黏附斑的增大而變快，與前面研究者得出的黏著斑大小和細(xì)胞遷移速度呈反比關(guān)系并不一致。這種結(jié)果的差異可能與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)因子的種類和濃度以及細(xì)胞的生長狀態(tài)不同有關(guān)。

細(xì)胞與支架的另一種方式為非特異性黏附，例如范德華力、離子力、靜電斥力等物理連接力。細(xì)胞通過感受這些物理力的刺激，并對其做出反應(yīng)，將物理機(jī)械信號轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞，對細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、分化產(chǎn)生重要影響。Chen等[1]通過在納米纖維上增加氨基基團(tuán)，從而增加其ζ電位。接種培養(yǎng)成纖維細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，支架材料的正ζ電位是陰離子細(xì)胞黏附所必需的，從而有利于細(xì)胞黏附。

4　在耳鼻咽喉科的應(yīng)用

在耳鼻喉頭頸外科領(lǐng)域，組織工程被廣泛地應(yīng)用在氣管黏膜、鼓膜再生和乳突氣房表面皮膚的再生。氣管內(nèi)壁覆有黏膜，其與皮膚的復(fù)層扁平上皮不同，為假復(fù)層柱狀纖毛上皮，具有呼吸調(diào)節(jié)、清潔、免疫等生理功能。當(dāng)其缺損或切除長度在成人達(dá)1/2、兒童達(dá)1/3時(shí)，其重建和功能恢復(fù)幾乎不可能[20]。近年來，組織工程化材料為這些問題提供了有效的解決方案。Shin等[21]研究了組織工程支架(兔BMSCs +豬軟骨粉支架)修復(fù)6只兔氣管缺損的情況。內(nèi)鏡觀察呼吸道上皮完全覆蓋再生氣管，重建區(qū)沒有狹窄，再生表皮纖毛運(yùn)動(dòng)頻率與正常黏膜無顯著差異。然而，較多研究者更希望利用資源豐富的干細(xì)胞和類氣管結(jié)構(gòu)的脫細(xì)胞氣管支架構(gòu)建工程化氣管。Gray等[22]將組織工程化氣管(自體羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞+異種脫細(xì)胞氣管支架)移植于胎兒羔羊，盡管術(shù)后所有氣管均存在狹窄，但與單純脫細(xì)胞組比較，工程化結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出完全的上皮化。在移植物中可以檢測供體細(xì)胞表現(xiàn)為假復(fù)層柱狀上皮。Batioglu-Karaaltin 等[23]使用組織工程氣管(兔ASCs+兔脫細(xì)胞氣管基質(zhì))修復(fù)兔氣管缺損。脫細(xì)胞組因吻合口區(qū)分離、氣道阻塞和感染等原因，僅存活(17±2)d。而實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物分別于30、60、90 d處死，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，組織工程氣管已整合到氣管側(cè)，增加了血管化。在纖毛上皮細(xì)胞中，上皮細(xì)胞下和整合的新氣管中均觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞。Gonfiotti等[24]首次在臨床使用組織工程氣管(自體表皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞來源的軟骨細(xì)胞+人脫細(xì)胞基質(zhì))為1例30歲末端左主支氣管軟化的患者進(jìn)行移植。術(shù)后1年，氣管吻合口附近的自體氣管出現(xiàn)漸進(jìn)性瘢痕性狹窄，而組織工程氣管開放，血管化和完全再細(xì)胞化，擁有呼吸上皮，具有正常的纖毛功能和黏液清除功能。

鼓膜穿孔是耳科常見疾病，臨床通過獲取周圍正常組織來修復(fù)穿孔，盡管效果較好，但取材損傷無法避免。此外，少數(shù)失敗病例再次手術(shù)時(shí)面臨組織來源受限問題。因此將組織工程技術(shù)用于此領(lǐng)域，極具挑戰(zhàn)意義，具有廣闊的應(yīng)用前景。

鼓膜表皮細(xì)胞層的潛在祖細(xì)胞和干細(xì)胞可能在鼓膜愈合中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[25]；許多研究已經(jīng)評估了生物分子和生長因子，如表皮生長因子和堿性成纖維生長因子在鼓膜的再生中產(chǎn)生顯著作用。目前，更多的鼓膜工程新策略則涉及生物工程支架材料，它們表現(xiàn)出良好的生物相容性和更高的穿孔愈合率。Hakuba等[26]設(shè)計(jì)了緩釋堿性成纖維生長因子的明膠水凝膠修復(fù)豚鼠鼓膜，單純明膠組僅3只耳鼓膜穿孔獲得菲薄閉合，實(shí)驗(yàn)組所有8只耳鼓膜穿孔均完全閉合。組織學(xué)觀察，除了黏膜和表皮的再生，中間纖維層也出現(xiàn)了再生。Qin等[27]用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)修補(bǔ)穿孔的豚鼠鼓膜，對比空白對照組，愈合效果明顯提升。術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組鼓膜大量的上皮細(xì)胞和扁平細(xì)胞附著到纖維層的兩側(cè)，與正常的結(jié)構(gòu)類似。Shen等[28]探究了絲素材料和豬源性細(xì)胞膠原Ⅰ/Ⅲ支架作為材料修補(bǔ)穿孔，2種材料在大鼠體內(nèi)有很好的相容性，產(chǎn)生很小的中耳組織反應(yīng)和炎癥，鼓膜無明顯的纖維化和骨生成。

開放性乳突根治術(shù)后需要定期清理術(shù)腔和換藥，直到術(shù)腔上皮化，達(dá)到干耳。一般上皮化需2～3個(gè)月，如果上皮化時(shí)間過長或未完全上皮化可直接影響手術(shù)效果且降低患者生活質(zhì)量。黃秀娟等[29]和楊柳等[30]先后使用異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix,ADM)進(jìn)行術(shù)腔骨壁的覆蓋。術(shù)后實(shí)驗(yàn)組術(shù)腔完全上皮化時(shí)間分別為4.2周、(54.5±12.1)d，對照組為11.5周、(70.1±14.3)d，在2次實(shí)驗(yàn)中組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明ADM應(yīng)用于乳突根治術(shù)中，可縮短術(shù)后上皮化時(shí)間。作者用ASCs與脫細(xì)胞基質(zhì)共培養(yǎng)，獲得ASCs膜片-脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合物，分別修復(fù)兔耳廓腹側(cè)皮膚和外耳道皮膚。與對照組(單純支架組和空白組)比較，實(shí)驗(yàn)組皮膚愈合明顯增快。組織學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組新生皮膚更加接近正常結(jié)構(gòu)，Western 印跡也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組能分泌更多的生長因子促進(jìn)傷口愈合。

5　問題與展望

迄今皮膚組織工程研究中對干細(xì)胞的選擇尚有較多問題：干細(xì)胞的鑒定，細(xì)胞誘導(dǎo)分化機(jī)制，如何形成穩(wěn)定的表皮、真皮間的連接結(jié)構(gòu)等。這方面必須通過對細(xì)胞的許多不同特征進(jìn)行研究(如體內(nèi)或體外的分裂行為、形態(tài)學(xué)及蛋白質(zhì)的表達(dá)、基因表現(xiàn)鑒定和分離干細(xì)胞等)，深入了解細(xì)胞在體內(nèi)的分化機(jī)制和信號傳導(dǎo)通路以及表皮真皮間的超微結(jié)構(gòu)等，從而有望得到理想的組織工程皮膚。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)單一支架材料難以滿足組織工程皮膚構(gòu)建的要求，需要通過化學(xué)和物理修飾，調(diào)整材料關(guān)鍵參數(shù)來重新整合支架。到目前為止，用支架、細(xì)胞因子、溫度和濕度等條件創(chuàng)造一個(gè)近似生理的微環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞朝著目標(biāo)細(xì)胞分化生長尚在探索中。近年發(fā)展的原位組織工程技術(shù), 或許有助于解決復(fù)雜的局部調(diào)控機(jī)制所帶來的問題。已有實(shí)驗(yàn)[31]證明，蛋白水解抗性血管生成肽納米纖維可以提供一個(gè)穩(wěn)定的原位組織工程臨時(shí)基質(zhì)，在減輕創(chuàng)傷面炎癥、增強(qiáng)新生血管形成和改善傷口愈合方面可以提供有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(本文編輯楊美琴)

Epithelial tissue engineering and its application in otolaryngology

ZHANGWen-jin＊,SUNJian-jun.

DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,NavyGeneralHospitalofPublicLiberationArmy,Beijing100048,China

SUN Jian-jun, Email: jjsun85@sina.com

As the body tissue, epithelium has the functions of protection, absorption，secretion and excretion. When people suffer from large epithelium defects, epithelium grafts (autografts or allografts) are usually used to treat wounds. However, the epithelial substitutes mentioned above have some clinical problems such as donor site damage or lack of the material. Recently, tissue engineering technologies for epithelium has made some progress. In this paper, the epithelial tissue engineering involving the seed cell, biological scaffold, the interaction between cells and scaffolds, and the application in otolaryngology were reviewed. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16:365-368)

Epithelium; Tissue engineering; Stem cell; Scaffold material; Otolaryngology

國家自然科學(xué)基金(81170904)

中國解放軍海軍總醫(yī)院全軍耳鼻咽喉-頭頸外科中心北京100048；＊安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院合肥230032

孫建軍(Email: jjsun85@sina.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.05.021

2016-01-11)